CAS-1细胞 星形细胞瘤分级IV细胞系，CAS-1细胞

星形细胞瘤分级IV细胞系，CAS-1细胞

 常见组织细胞的培养方法

体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下:

一节 上皮细胞培养

上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。

体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca²⁺含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。星形细胞瘤分级IV细胞系，CAS-1细胞

以表皮细胞为例，用皮肤表皮和分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）

1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。

2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。

3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。

4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与层分开。

5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。

6、反复吹打，制成悬液。

7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。

8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。

第二节 内皮细胞培养

内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。

研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法为简便，其法如下：

1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。

2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。

3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。

4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。

5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

第三节 神经细胞培养

神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。

人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。

一、设备： 无菌操作设备。

二、大型设备CO₂ 培养箱：恒温5%、10%CO₂维持培养液中pH值。

倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况。

解剖显微镜，用于准确地取材。星形细胞瘤分级IV细胞系，CAS-1细胞

常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶。

低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂。

电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿。

高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械。

过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌。

渗透压仪，pH剂，天平等。

三、培养器皿及手术器械

1、培养皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直径。

2、培养板，24-40孔，可用于开放培养。

3、培养瓶：

4、吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

5、各类培养液贮存器。

6、小型手术器械。

准备：

一、配制培养液

（1）解剖液：以无机盐（去除Ca²⁺ , Mg²⁺）加葡萄糖配制成PBS缓冲液，保持一定的渗透压和pH值。

（2）基础培养基（MEM）：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。

（3）接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%马血清，当天配制。

（4）维持培养液：接种后24h，全部换成此液，后每2周换一次，每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。

二、培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶

三、消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d，达两次ddH₂O，每遍洗刷3-4次，加塞包装，置于烤箱中干燥消毒，于培养前1天进行。

神经细胞分散培养

（一）选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。

（二）取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。

（三）细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1×10⁶），做电生理应为5×10⁵或更低。

SUER0902(XR)     697细胞，急性淋巴细胞B细胞白血病细胞

SUER0903(XR)     5637细胞，

SUER0904(XR)     1321N1细胞，星形细胞瘤细胞

SUER0905(XR)     143B细胞，

SUER0906(XR)     22Rv1细胞，

SUER0907(XR)     23132/87细胞， 腺癌；恶性腺瘤细胞

SUER0908(XR)     253J细胞，移行细胞癌细胞

SUER0909(XR)     253J-BV细胞，移行细胞癌细胞

SUER0910(XR)     42-MG-BA细胞，星形细胞瘤分级IV细胞

SUER0911(XR)     59M细胞，移行细胞癌细胞

SUER0912(XR)     639-V细胞，移行细胞癌细胞

SUER0913(XR)     647-V细胞，

SUER0914(XR)     769-P细胞，透明细胞肾细胞癌细胞

SUER0915(XR)     786-O细胞，透明细胞肾细胞癌细胞

SUER0916(XR)     8305C细胞，未分化癌细胞

SUER0917(XR)     8505C细胞，未分化癌细胞

SUER0918(XR)     8-MG-BA细胞，星形细胞瘤分级IV细胞

SUER0919(XR)     A101D细胞，

SUER0920(XR)     A1207细胞，

SUER0921(XR)     A172细胞，星形细胞瘤分级IV细胞

SUER0922(XR)     A-204细胞，

SUER0923(XR)     A2058细胞，

SUER0924(XR)     A-253细胞， 粘液表皮样癌；粘表皮癌细胞

SUER0925(XR)     A2780细胞，恶性肿瘤，腺癌细胞

SUER0926(XR)     A3/KAW细胞，弥漫大B细胞淋巴瘤细胞

SUER0927(XR)     A-375细胞，

SUER0928(XR)     A4/Fuk细胞，弥漫大B细胞淋巴瘤细胞

SUER0929(XR)     A-498细胞，肾细胞癌细胞

SUER0930(XR)     A549细胞，非小细胞癌细胞

SUER0931(XR)     A-673细胞，

SUER0932(XR)     A-704细胞，肾细胞癌细胞

SUER0933(XR)     ABC-1细胞，非小细胞癌细胞

SUER0934(XR)     ACC-MESO-1细胞，

SUER0935(XR)     ACHN细胞，肾细胞癌细胞

SUER0936(XR)     AGS细胞，腺癌；恶性腺瘤细胞

SUER0937(XR)     Alexander cells细胞，肝癌细胞

SUER0938(XR)     ALL-SIL细胞，急性淋巴细胞B细胞白血病细胞

SUER0939(XR)     AM-38细胞，星形细胞瘤分级IV细胞

SUER0940(XR)     AML-193细胞，急性髓性白血病细胞

SUER0941(XR)     AMO-1细胞，浆细胞瘤细胞

SUER0942(XR)     AN3 CA细胞，星形细胞瘤细胞

SUER0943(XR)     AsPC-1细胞，导管癌细胞

SUER0944(XR)     AU565细胞，

SUER0945(XR)     AZ-521细胞，

SUER0946(XR)     BC-3C细胞，移行细胞癌细胞

（四）YZ胶质细胞生长。培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FUYZ神经胶质细胞的生长。

（五）观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周宜。

但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。

（六）常用培养细胞实验有：FCM的蛋白总量分析；膜片钳与离子通道的分析；免疫组化分析；

但免疫组化分析应注意，由于抗体直接作用于活细胞，不易穿透活细胞，故对核内抗原定位时，首先考虑膜对抗体的通透性问题。常用化学试剂以增加其通透性或采用冰冻方法解决。

在免疫组化中，或其它组织学染色中，常用不同的染色方法以区分不同细胞，如半乳糖脑苷脂对小树突胶质细胞标记明显；GFAP对星形胶质细胞具有特异性染色等。这对研究神经系统中胶质细胞功能具有极大的应用价值。神经胶质细胞以往多被忽视，其在脑血管疾病（如缺血性损伤）、退行性疾病（如AD、PD）、损伤后胶质细胞的填充等具有不可忽视的作用。它也是神经细胞功能和营养支持的物质基础。

第四节 肌组织细胞培养

各种肌组织均可用于培养，以心肌和骨骼肌较实用。

（－）骨骼肌细胞培养

1、出生1一2天的乳鼠，引颈处死。

2、无菌取大腿肌组织，切成0.3一0.5cm²小块后，用不含钙镁离子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过。

3、计数调整细胞密度。

4、快接种量2×10⁶/皿入培养基培养。

5、培养基内含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促进分化。

接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化，明胶配置：用Hanks液配成0.01%明胶。

该细胞接种率约50%，细胞生长开始呈纺锤形，培养50－52小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时可观察到横纹，一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。

（二）心肌细胞培养

心肌细胞是早的培养材料，Carrel曾长期培养过心肌组织，至今心肌仍不失为好的培养物，常用的是鸡胚心肌。

心肌比较容易培养和生长，可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法，均可获良好的效果。取心室肌培养较好，原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，培养成功时，一周后可见节律性收缩现象。星形细胞瘤分级IV细胞系，CAS-1细胞

第五节 巨噬细胞培养

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法为实用，其法如下：

1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。

2、引颈处死小鼠。

3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。

4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。

6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。

7、小心拔出针头，把液体注入离心管。

8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。

9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×10⁶细胞，其中90%为巨噬细胞。

10、以3×10⁵个贴附细胞/平方厘米接种。

11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO₂温箱中。

第六节 肾小球分离、移植培养

SD大鼠颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡1～2分钟，2次，置超净台内，打开腹腔取出肾脏剪碎，置含Hank's液的无菌培养皿洗涤，置80目不锈钢筛网上。用扁平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网，滤过组织Hank's液混合物用吸管吸至120目不锈钢筛网，滤过，去小组织块，滤过物吸至200目不锈钢筛网，轻轻滤过，Hank's液洗涤1次，收集网上肾小球，镜下观察为分离良好的肾小球。

肾小球用0.2%胰酶、0.1%胶原酶，37℃消化20分钟，加血清终止胰酶反应，离心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至24孔培养板或25ml培养瓶，使肾小球大于60个/cm²，加培养基5～10ml（培养基组成：F12—3T3上清1：1；5%马血清；2.5%胎牛血清；胰岛素5μg/ml；25ng/ml氢化可的松；5μg/ml转铁蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲状腺素0.02ng/ml；D-缬氨酸150ng/ml）肾小球培养8～10天，去除肾小球未生长组分，细胞继续培养24小时，形态学观察：细胞生长成单层多角型细胞，直径约100μm。

第七节 裸小鼠移植瘤单细胞分离培养

无菌条件下取出小鼠移植瘤组织，剪成1mm3小块，用0.5%胶原酶室温消化30分钟到1小时，再加等体积0.2%胰酶消化5～8分钟，在消化过程中用吸管吹打组织块或用自制装置（分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接而成，滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞）来回推动注射器吹打组织以分离单细胞，终止酶消化方法同上。

常规方法接种培养收获细胞。

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