1 目的：利用多能干细胞无血清培养基，长时间培养人类多能干细胞 (hPSC) 支持细胞增生并且维持细胞多能性。
* 人类多能干细胞 (hPSC) 包含人类胚胎干细胞 (hESC) 及人类诱导多能干细胞 (hiPSC)。
2 材料：人类多能干细胞 (hPSC)。
3 主要仪器：生物安全柜，CO2培养箱，6孔培养板。
4 试剂：
| 品Pai | 货号 | 名称 | 规格 | 保存条件 |
Biological
Industries | 05-100-1A | NutriStem® hPSC XF Medium
多能干细胞无血清培养基 | 500ml | -20℃ |
| Biological Industries | 05-753-1F | LaminStem™ 521
重组层粘连蛋白 | 1ml | -20℃ |
| Biological Industries | 03-048-1C | SBTI Solution (50x)
大豆胰酶YZ剂（50倍浓缩液） | 20ml | -20℃ |
| Biological Industries | 03-079-1B | Recombinant Trypsin-EDTA solution 重组胰酶 | 100ml | 常温 |
| Biological Industries | 02-020-1A | DPBS, with Ca2+and Ma2+
含钙/镁离子DPBS缓冲液 | 500ml | 4℃ |
| Biological Industries | 01-862-1B | 0.5M EDTA Solution
0.5M EDTA溶液 | 100ml | 常温 |
| Biological Industries | 05-710-1B | CryoStem™ hPSC Freezing Medium hPSC无血清冻存液 | 100ml | 4℃ |
| Biological Industries | 02-023-1A | DPBS (w/o Ca & Mg)
DPBS缓冲液 | 500ml | 常温 |
| Biological Industries | 01-172-1A | DMEM/F-12（1:1）
DMEM/F-12培养基 | 500ml | 4℃ |
5 NutriStem® hPSC XF Medium准备
5.1 在2-8°C或室温下解冻NutriStem® hPSC XF Medium，即可使用。
5.2 将NutriStem® hPSC XF Medium储存在2-8°C，2周内使用完毕。
5.3 使用前，请将NutriStem® hPSC XF Medium加热至室温（15-30°C），为了确保介质的稳定性，只需加热所需的量。
5.4 如需分次使用，请分装成单次使用体积，并避光保存，避免反复冻融。
6 用基质胶 (Metrigel) 培养hPSC细胞
6.1 准备基质胶
6.1.1 冻存的基质胶需在冰上过夜解冻, 避免成胶。
6.1.2 利用预冷的DMEM:F12 (1:1) 培养基1:1稀释基质胶, 并以预冷的无菌移液管混合均匀。
6.1.3 混合液需保持在冰上, 分装到预冷的15ml离心管, 再保存至-70°C。
6.2 制备基质胶预包被培养盘
6.2.1 缓慢地在冰上解冻基质胶分装液，避免成胶。
6.2.2 利用预冷的DMEM:F12 (1:1) 培养基1:20稀释基质胶。
6.2.3 将1ml稀释的基质胶溶液，加入到6孔盘的每个孔盘中, 在室温孵育1小時或2-8°C孵育过夜。须确保基质胶完全覆盖孔盘表层。
6.3 酵素消化法细胞传代操作程序
建议使用胶原酶IV (1mg/ml)； 若使用其他酵素，如分散酶 (Dispase) 或重组胰酶，请自行调整条件。
6.3.1 移除培养盘中的培养基，用已预热DMEM：F12（1:1）培养基轻轻润洗1次。
6.3.2 每个板孔中加入1ml已预热胶原酶IV (1mg/ml)。
6.3.3 在37°C、5% CO2培养箱孵育5-10 min (孵育时间切勿过长)，并在显微镜下观察细胞形态，细胞边缘会开始卷曲。
6.3.4 吸弃胶原酶溶液，小心用DMEM: F12 (1:1) 至少润洗1次。
6.3.5 每孔加入适量已预热NutriStem® hPSC XF Medium。
6.3.6 用5ml玻璃移液管，轻轻将hPSC群落刮下并收集, 重复3-4次, 直到所有的hPSC悬浮在NutriStem® hPSC XF Medium。脱落的hPSC团块谨慎吸出并移到离心管内。利用细孔径的移液管轻轻吹打hPSC细胞，使细胞形成小团块 (请避免团块太小，使存活率降低)。
6.3.7 准备新基质胶包被6孔盘，小心地用DMEM: F12 (1:1) 至少润洗1次，每孔加入3ml NutriStem® hPSC XF Medium。 用5ml移液管轻轻地将1ml细胞接种至每个孔, 使细胞均匀分布在孔盘中, 并放入37℃、5% CO2培养箱内培养。
6.3.8 48小时后，每天更换一次2.5-3ml新的NutriStem® hPSC XF Medium，直到hPSC细胞形成大细胞群落。
* 的培养密度：用1:6-1:8传代率，细胞可分裂3-4天（6孔盘中的单孔，可传代一个新6-8孔盘）；如果细胞太密集或太稀疏，请调整细胞接种比率。
6.4 非酵素消化法细胞传代操作程序
6.4.1 0.5mM EDTA 分离溶液配置：50μL的0.5M EDTA与50ml无钙/镁离子DPBS（BI Cat＃02-023-1）混匀后无菌过滤即可使用；室温可储存6个月。
6.4.2 用2ml无钙/镁离子DPBS润洗传代细胞6孔盘2次。
6.4.3 加入1ml 0.5mM EDTA溶液，旋转孔盘以覆盖整个细胞表面，并迅速吸出 (此步骤为移除培养环境中的钙和镁离子，避免影响后续EDTA分离细胞效果)。
6.4.4 加入1ml 0.5mM EDTA，在室温或37℃孵育4-5分钟（孵化时间和温度，不同细胞株会有所不同；hPSC细胞株，3-4分钟室温即可）。
6.4.5 以1ml枪头吹打细胞3-4次，让细胞集落形成小团块，谨慎将细胞团块重悬在适量NutriStem® hPSC XF Medium (不要刮或过多的吹打细胞，避免形成单颗细胞悬浮)。
6.4.6 将小的细胞团块按照不同细胞株所需比例 (1:8-1:20)，转移至含3ml NutriStem® hPSC XF Medium的玻璃粘连蛋白包被孔中。
6.4.7 将培养盘放入37℃、5% CO2培养箱内培养。
6.4.8 48小时后，每天更换一次2.5-3.0ml新的NutriStem® hPSC XF Medium，直到hPSC细胞形成大细胞集落。(48小时内不要移动盘子，可能会使细胞分化)。
7 用层粘连蛋白 (Laminin) 培养hPSC细胞
层粘连蛋白包被建议浓度为：0.5-1μg/cm2，详细说明请参阅该产品说明书。
7.1 制备层粘连蛋白包被培养盘 (0.5μg/cm2)
7.1.1 在2-8°C缓慢解冻无菌层粘连蛋白。
7.1.2 稀释LN521 (每孔：50μL LN521+ 2ml 无钙/镁离子DPBS)：用12ml的无钙/镁离子DPBS稀释300μL的LN521（0.1mg/ml）。
7.1.3 加2ml稀释的LN521至每个孔。
7.1.4 用石腊膜（例如Parafilm®）密封培养盘防止水分蒸发，并在2-8°C孵育过夜，确保层粘连蛋白溶液均匀覆盖孔盘表面。
* 包被期间，注意请勿让包被液干掉！防止层粘连蛋白失去活性。
7.2 用LN521培养细胞传代步骤（酵素法，6孔盘的单孔使用体积）
7.2.1 每孔加2ml无钙/镁离子DPBS小心润洗2次，根据培养盘适量加入1ml重组胰酶，覆盖整个细胞表面，在37°C孵育 2-4min (孵育时间切勿过长)。
7.2.2 轻轻拍打培养盘帮助细胞脱落，加入4ml大豆胰酶YZ剂，并轻摇培养盘。
7.2.3 谨慎吸出细胞悬液，收集到离心管中；利用1ml移液管轻轻吹打hPSC细胞，使细胞形成小团块, 室温200 g离心5min。
7.2.4 去上清，将细胞团块小心重悬至1ml NutriStem® hPSC XF Medium中，并计算细胞数。
7.2.5 将细胞以10-20,000 /cm2细胞密度，接种至层粘连蛋白预包被培养器皿中，并加入3-4ml NutriStem® hPSC XF Medium。
7.2.6 在37℃、5% CO2培养箱内培养，48小时后，每天更换一次2.5-3ml新的NutriStem® hPSC XF Medium (48小时内不要移动孔盘，可能会使细胞分化)。
* 大多数多能干细胞增值数，会在培养4-6天后达到10-25倍。
NutriStem® hPSC XF Medium 多能无血清培养基（通过美国FDA DMF：30984，国外可用于临床）
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