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生物药物分析方法开发\分析方法验证

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蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。在尼尔·伯奈特(Neal
Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹( Western
Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western
Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，"探针"是抗体，"显色"用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

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试剂准备

1.SDS-PAGE试剂:见电泳实验。

2.匀浆缓冲液:1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巯基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。

3.转膜缓冲液:甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS
0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

4.0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g;KCl
0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。

5.膜染色液:考马斯亮兰 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉，现配):脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6.显色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸镍胺 0.1ml;H202 1.0μl。

折叠样品制备

1.单层贴壁细胞总蛋白的提取:

(1)倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。

(2)每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

(3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100mM)，摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)

(4 )每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

(5 )裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

(6 )于4℃下12000rpm离心5min。(提前开离心机预冷)

(7 )将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于-20℃保存。

2. 组织中总蛋白的提取:

(1 )将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

(2)加400 μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。

(3 )几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

(4) 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取:

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按(一)操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:

(1 )将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

(2 )弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

(3)用枪洗干上清后，加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

(4)将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

折叠含量测定

1. 制作标准曲线

(1 )从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

(2) 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，20.0mg，40.0mg。

(3 )按下表在各管中加入各种试剂。

(4)混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计(Bio-Photometer，Eppentoff)上比色分析。

2. 检测样品蛋白含量

(1)取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。

(2 )取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

(3 )弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL)，再用无菌水洗一次。

(4) 取一管考马斯亮蓝加95 ml0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意:每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5ml样品含的蛋白量。

SDS-PAGE电泳

1.清洗玻璃板:

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

2. 灌胶与上样

(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。)

(2) 按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。)垂直电泳槽

(3 )当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

(4 )按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

(5 )用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。)

(6) 测完蛋白含量后，计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。(上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的Z大限度可加20 μl样品。)上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。

(7)加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

3.电泳

电泳时间一般4~5 h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

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