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背景： 皮质醇是由肾上腺的束状带分泌的Z主要的糖皮质激素，又名化合物F，属甾体糖皮质激素类，其分泌受腺垂体促肾上腺皮质激素的控制。血液的皮质醇分为游离型和结合型两种。游离型皮质醇为活性部分，能进入靶细胞发挥生理效应；结合型主要与皮质类固醇结合球蛋白相结合，约占95%以上，不能自由扩散，故不见生理效应。血皮质醇测定是直接反映肾上腺皮质的分泌功能。唾液较易采集，但不能反映单个腺体的状况。唾液成分中水占99%以上，其中有机物约占0.5%，无机物约占0.2%。此外，还有少量红细胞，上皮细胞等。影响唾液分泌因素很多，诸如内因和外因等因素。因此唾液成分不够恒定，采集时间Z好限定于午后2～4h为宜。
唾液皮质醇的测定原理

本法是标记抗原（Ag^·）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争YZ反应，其反应为Ag^·＋Ag＋Ab（Ag^·Ab）＋（AgAb）。当Ag^·和Ab的量保持恒定，Ag与Ag^·之和大于Ab上的有效结合点的数目，在该条件下，Ag与Ag^·间存在着函数关系，亦即随着Ag浓度增加，Ag-Ab生成量多，而Ag^·-Ab的数量则减少，游离的Ag^·就增多。因为Ag^·对Ab的结合，可因Ag竞争结合而遭YZ。反之，当Ag量少时，Ag-Ab生成量就少，Ag^·-Ab量增多，而游离的Ag^·减少（图1）。将结合的抗原抗体复合物（B）与游离抗原（F）分离，分别测定B和F的放射活性，计算出B/F或B/B＋F值，可制出B/F或B/B＋p对Ag量的关系曲线图。测定时，需用一系列已知浓度的Ag和一定量Ag^·及相应抗体Ab混合，然后测出各标准浓度Ag参加下的Ag^·-Ab放射结合率（B/B＋F）或（B/F），绘出竞争YZ标准曲线（图2）。试验时，在同样条件下，根据被测Ag的放射性结合率，从标准曲线上查知相应Ag含量。

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⒈ 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

⒉ 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

⑴ 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。当前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

⑵ 包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃18~24小时。蛋白质包被的Z适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值Z大而蛋白量Z少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。

⑶ 酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取"方阵法"(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

⑷ 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是当前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品(这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内)。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。

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亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯(biotin-hydroxysuccinimide，BNHS)可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。

亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。

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