TonkBio 无缝克隆试剂盒 现货厂家促销

产品名称：TonkBio同源重组试剂盒
英文名称：TonkBio Quick-Fusion Cloning Kit   
产品规格：

产品编号	产品规格	产品价格
TB10012A	10 rxns	￥441

产品组成：
1、Fast-Fusion Enzyme
2、10× Fast-Fusion Buffer
产品简介：
TonkBio 同源重组试剂盒基于DNA序列同源性进行片段重组，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’Z末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～21 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在Fast-Fusion Enzyme的催化下，Z快仅需反应5 min，即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。
产品特点：
1、操作简便：无需考虑酶切点限制；
2、快速重组：15min实现载体和片段的快速重组；
3、效率更高：重组效率为传统酶切连接技术的5-10倍，无载体自连现象，阳性克隆可达90%以上。
产品应用：
1、PCR产物克隆进载体
2、基因转移
3、在插入片段前后插入adaptor、linker和标签
4、高通量克隆
实验方案

B．制备线性化载体
环形载体需要经过线性化处理，使载体待重组区域暴露出来，以供与插入片段进行重组拼接。线性化的方法可以通过限制性内切酶酶切或PCR方法实现。若采用酶切进行线性化处理，推荐进行琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收，以尽量避免为切割载体在转化后造成假阳性结果。若PCR扩增得到线性化载体，推荐使用高保真聚合酶进行扩增，减少PCR体系中的模板用量以减少初始质粒造成的假阳性，并在PCR结束后对产物进行切胶回收或使用DpnI酶消化残余质粒模板。
 
C. 插入片段的PCR引物设计
为了实现同源重组，插入片段扩增产物5’和3’末端需要带有和线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列（15−21 bp）。下图以pUC19作为克隆载体为例，设计引物：

	Forward Primer →
	15 bp tract (F)        BamHI   Gene-specific Primer
	5’-CAG GTC GAC TCT AGA GGATCC XXX XXX …-3’
Vecor pUC19 Clone site	5’-TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA G	AATTC ACT GGC CGT CGT TTT ACA ACG-3’
	3’-ACG GAC GTC CAG CTG AGA TCT CCTAG	G TGA CCG GCA GCA AAA TGT TGC-5’
	3’-… XXX XXX CTTAAG TGA CCG GCA GCA AAA-5’
	Gene-specific Primer  EcoRI      15 bp tract (R)
	← Reverse Primer

D. 插入片段的PCR扩增
插入片段可选用任何DNA聚合酶进行扩增，Taq DNA聚合酶或其他具有校正活力的高保真酶都可以。若用Taq DNA聚合酶，产物末端的A尾在重组过程中将会被去除，不会因此产生单碱基插入突变。推荐使用高保真酶进行扩增，以减少在插入片段中引入突变。请在PCR完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，确认获得单一条带的DNA片段。可切胶回收以除去模板、引物、引物二聚体。可通过与已知的DNA分子量marker比较，确定得到的DNA量。
 
E．重组反应体系的建立以及反应条件
在冰水浴中，配制如下反应体系，将缓冲、水、线性化载体、插入片段加入PCR管中，轻弹混匀，加入酶。

组成成分	用量
10× Fast-Fusion Buffer	1 μl
线性化载体	20−100 ng
插入片段	10−100 ng
ddH2O	补加至10 μl
Fast-Fusion Enzyme	1 μl *

Z适线性化克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，可由下列公式粗略计算获得：
Ø 线性化载体 = [0.01 × 线性化载体长度 (bp)] ng
Ø 插入片段 = [0.01 × 插入片段长度 (bp)] ng
例如将长度500 bp的插入片段克隆到长度2.7 kb的pUC19中，克隆载体的Z适使用量为：0.01×2700=27 ng，插入片段的Z适使用量为：0.02×500=10 ng。
注意：1. 当插入片段大于克隆载体时，两者计算用量公式应互换。
2. 线性化载体用量应在20−100 ng之间，插入片段扩增产物用量应在10−100 ng之间。当使用上述公式计算DNA用量超出这个范围是，请直接选择/使用量即可。例如插入片段200 bp，Z适用量计算值为4 ng，实际反应体系中应加入10 ng。
反应体系配制完成后，轻弹混匀，并通过短暂离心使其沉到管底，立即放入已预热的PCR仪或平衡至所需温度的水浴中。按下表中方案选其一进行。推荐在PCR仪中进行反应，60°C，15 min。（若选择在37°C水浴反应，请在10 μl反应中加入2 μl Fast-Fusion Enzyme。）反应结束后应立即将反应管置于冰水浴中冷却10 min，然后直接转化。也可选择−20°C储存，待需要时，冰上解冻并转化。

PCR热循环仪		水浴
70°C, 5 min	60°C, 15 min	37°C, 15 min
4°C, ∞	4°C, ∞	冰水浴

 
F．转化
推荐使用转化效率≥10⁸ cfu/μg的感受态细胞，按照对应的说明书操作。若转化效率低于10⁸ cfu/μg，可在凃布前将培养的菌液在6000 rpm离心5 min，沉菌用100 μl培养基重悬后，全部涂于对应抗性的平板上。过夜培养后，形成数百个单克隆，可根据需要选择PCR或酶切鉴定是否为阳性。
 
G．常见问题与解决方案

问题	可能的原因	解决方案
平板上无克隆或克隆数目很少	引物序列不正确	l 确认引物序列含有15 bp与载体插入区域完全一致的同源序列。
	PCR产物不纯	l 优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物。 l 换一种纯化方法，纯化您的PCR产物。
	反应体系中DNA浓度太低	l 在重组反应中，加入推荐的DNA量。
	不纯的载体或插入片段YZ重组反应	l 推荐采用胶回收或离心柱法纯化DNA后进行重组反应。
	转化过程中加入重组反应液过多	l 重组反应液的转化体积不应超过转化细胞体积的1/10。
	感受态细胞转化效率低	l 更换新鲜、GX的感受态细胞。
	培养基中加入错误或过多抗生素	l 在转化平板中加入正确、适量的抗生素。
假阳性克隆数目多	克隆载体线性化不完全	l 重新酶切您的载体，增加酶切时间，并胶回收纯化。
	PCR使用的模板质粒抗性与所需克隆载体抗性相同造成的污染	l 可在PCR反应之前先将模板质粒线性化。 l PCR产物用DpnI处理，消化模板质粒，然后再纯化。
	转化用平板放置时间过长导致抗性失效	l 确认平板新鲜配置，并含有正确、适量的抗生素。
克隆含有不正确的插入片段	PCR产物混有非特异性片段	l 优化PCR扩增体系，提高特异性或胶回收纯化目的片段。