玉米赤霉烯酮ELISA定量检测试剂盒

玉米赤霉烯酮ELISA定量检测试剂盒
生产商：意大利EuroKit公司 总经销商：北京中检维康技术有限公司

引言：
玉米赤霉烯酮属于真菌毒素，与其它真菌毒素一样，它是第二代代谢的降解产物。玉米赤霉烯酮是由各种镰刀菌产生的。这些霉菌在收割的时候就感染了谷物、花生、大豆。当牛吃了一定数量污染了玉米赤霉烯酮的饲料时，在牛乳中就能够检测到玉米赤霉烯酮。甚至在啤酒中也检测出了玉米赤霉烯酮。玉米赤霉烯酮是一种作用强烈的雌激素。它能够使子宫增大，卵巢腺缩小，甚至不育。玉米赤霉烯酮是农产品中一种主要的污染物，它对人类和动物存在着极大的危害。
为了保护人类，避免因玉米赤霉烯酮而诱发产生疾病，除了进行适当的卫生防疫，应该加强对有危害的食品和饲料进行定量和定性的检测控制，防止玉米赤霉烯酮的产生。玉米赤霉烯酮酶联免疫吸附试剂盒是一种快速、经济、灵敏的分析方法。与其它分析方法相比，黄曲霉毒素M1试剂盒具有更高的灵敏度，不需要复杂的仪器设备等优点。经过适当的样品处理后，在200分钟内可以检测40多个样品。

试验方法的原理
玉米赤霉烯酮试剂盒的工作原理是酶联免疫吸附分析法。玉米赤霉烯酮偶联物包被在酶标板的小孔中，将含有玉米赤霉烯酮的样品或者是标准液和兔抗玉米赤霉烯酮的抗体加入到小孔中，此时固相包被的玉米赤霉烯酮和样品、标准品中游离的玉米赤霉烯酮竞争性地与抗体进行反应。在室温温育2小时后，用稀释过的洗液清洗小孔，将未反应的物质冲走。在小孔中再加入兔抗过氧化物酶偶联物，在室温温育60分钟。再次清洗后，加入底物溶液，温育20分钟，结果产生兰色。加入停止液，终止颜色反应，颜色变成黄色。用酶标仪在450nm处测定颜色的强度，玉米赤霉烯酮的浓度与颜色强度成反比关系。

注意事项：
为了保证测定结果的可靠性，请按照下列良好实验室操作规范（GLP）进行实验
1． 在进行分析操作之前，请将所有的试剂回温到室温(20-25°C)。
2． 所有的试剂在使用前，通过翻转摇动进行充分的混合，但不要引起泡沐的产生。
3． 一当实验开始，所有的操作步骤应该在规定的时间内完成，不要中断或者超时。
4． 所有的试剂瓶操作完成后立即盖好盖，不要将不同试剂瓶的盖混用。
5． 每个样品只能用自己的吸头，不能混用，防止交叉污染。
6． 所有的样品和标准物必须同时使用，所有的试验条件保持一致。
7． 不要将不同批次的试剂混用。
8． 不要使用过期的试剂。
9． 要经常的检查酶标仪和微量移液器的精度和准确度。

健康和安全注意事项
1． 在实验室不要吸烟、吃东西、喝水、用嘴吸移液管。
2． 避免底物和停止液与皮肤和粘膜接触（可能产生刺激、灼烧和有毒危害）。如果接触了，请用大量的水进行清洗。
3． 化学物品的处理必须按照良好实验室操作规范（GLP）进行。
4． 玉米赤霉烯酮是毒性极强的物质。它们能够致癌、对基因造成不可修复的损伤。吸入、吞食和皮肤接触，黄曲霉毒素均会致毒。所以，试验人员必须穿防护服。

试剂盒中所包含的试剂：
试剂盒的试剂可以进行96次检测。在+2至 +8°C，保质期为6个月。在试剂盒的外包装和每个试剂瓶上均表明有有效时间。
1． 每块酶标板包括12条，每条含有8个小孔，每个孔中均包被有玉米赤霉烯酮偶联物。
2． 玉米赤霉烯酮标准液浓度为：0, 0.5, 2, 20, 200 ng/ml，每瓶1 ml。如果储藏在冰箱中，则会有结晶沉淀产生，需要将其置于37 ° C的水浴中温育15分钟。
3． 兔抗玉米赤霉烯酮的抗体：6 ml，打开即用。
4． 酶标记物（抗兔过氧化物酶）：11 ml，打开即用。
5． 底物溶液（TMB）：11 ml，打开即用。
6． 停止溶液(0.5 M H2SO4)：11 ml，打开即用。
7． 标准溶液/样品稀释液(PBS/BSA)：60 ml，打开即用。如果储藏在冰箱中，则会有结晶沉淀产生，需要将其置于37 ° C的水浴中温育15分钟。
8． 洗液(PBS + Tween 20)：60 ml，10倍浓缩液。按1：9的比例，将其与蒸馏水进行稀释备用。如果冷藏时，有晶体沉淀产生，应该将浓缩液在37°C下回温15分钟。
9． 两片塑料薄膜：在温育过程中，用其将反应的酶标板盖严避光。
10． 塑料袋：用于储藏未用完的酶标板。
11． 操作手册。
需要的其它试剂和设备（试剂盒没有提供）：
50、100、500 and 1000 µl移液器，容量瓶，混合器，离心机，酶标仪450nm滤光片，酶标板用的摇床，甲醇，二次蒸馏水。

样品的制备：
样品如果是谷物、坚果，需要粉碎成细至中细程度。如果是面粉，则可以省掉这一步。
取2克粉细的样品，加入10mL甲醇：0.01M的PBS溶液（60：40），在水平摇床上以至少120次/分钟的频率振荡30分钟，也可以用磁力搅拌器搅拌30分钟。然后在离心机上以至少2000转/分的转速离心5分钟，将水相用样品稀释液以1：9的比例进行稀释。此时，即可以提供给ELISA分析用。

试剂的制备：
因为试剂盒中提供的标准品是10倍浓缩液，所以在使用之前必须按1：9的比例用样品稀释液进行稀释（即50 µl标准+450 µl样品稀释液）。

ELISA分析操作步骤：
1． 按照上述的介绍制备样品。
2． 移取100 µl的稀释好的标准溶液和样品（每个做2次平行实验），置于酶标板的小孔中。随后立即加入50 µl抗玉米赤霉烯酮的抗体。
3． 用塑料薄膜将酶标板盖好，在室温下置于摇床上温育120分钟（不用摇床，温育180分钟）。
4． 分别每次用300 µl稀释好的洗液将每个小孔清洗3次。翻转将酶标板小孔中的溶液倒掉，在废纸上将酶标板拍打，使其中的溶液清净，重复3次。清洗过程十分重要。做的不好，测定结果的重复性会比较差，造成吸光度值偏高。
5． 分别移取100 µl酶标记物（抗兔过氧化物酶）置于酶标板的小孔中，用塑料薄膜将酶标板盖好，在室温下置于摇床上温育60分钟（不用摇床，温育90分钟）。
6． 再次分别每次用300 µl稀释好的洗液将每个小孔清洗3次。翻转将酶标板小孔中的溶液倒掉，在废纸上将酶标板拍打，使其中的溶液清净，重复3次。清洗过程十分重要。做的不好，测定结果的重复性会比较差，造成吸光度值偏高。
7． 分别移取100 µl底物溶液置于酶标板的小孔中。
8． 将酶标板置于暗处（ 例如抽屉、盒子中，显色剂对光比较敏感），在室温下反应20分钟。
9． 分别移取100 µl停止液(0.5 M H2SO4) 置于酶标板的小孔中，使酶反应停止。兰色立即变成黄色。
10． 混匀后，在酶标仪上用450 nm（参比波长620 nm）进行测定。颜色可以稳定30分钟。

测定结果的计算：
1． 计算光密度（450 nm处）的平均值。
2． 制作标准曲线：在半对数坐标纸上，取光密度平均值作为纵坐标（Y），标准溶液的浓度值作为横坐标（X）。
3． 对于每个样品，用其光密度平均值在标准曲线上找对应的浓度值。
4． 稀释过的样品必须要乘以稀释因子（倍数），才是的测定结果（以ng/kg表示）。用本方法制备的样品，稀释因子是50。

典型的标准曲线值：
下列数据是一条典型的标准曲线值。吸光度值表示为与0 ng/ml标准的吸光度值相比所占的百分率。这些值只是一个典范，不能代替平时每次试验所做的标准曲线。
玉米赤霉烯酮浓度(ng/ml) 0 0.5 2 20 200
吸光度值（与0标准溶液吸光度值比值的百分率）(% of 0 pg/ml-Standard) 100 90 81 42 15

试剂盒的技术指标：
灵敏度：250皮克/毫升（0.25ppb）
精密度：0 ng/ml，变异系数3.1 %；200 ng/ml，变异系数4.3 %。（20次试验）
回收率：面粉（添加回收）：90  5 %

References

1. Teuscher E and Lindequist U (eds). Auflage, Gustav Fischer Verlag, 1994: Biogene Gifte – Biologie, Chemie, Pharmakologie 2.
2. Ueno I (ed). Elsevier science ISBN 0-444-99661-3, 1983: Trichothecenes: chemical, biological and toxicological aspects.
3. Scott Peter M. JAOAC vol. 70, 2, 276-281, 1987: Mycotoxins.