SILAC (细胞培养条件下稳定同位素标记技术,Stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC) 其基本原理是分别采用含有轻、中或重型同位素必需氨基酸的培养基培养细胞(用于SILAC的稳定同位素氨基酸主要有Lys和Arg),新合成的蛋白质即嵌合了同位素氨基酸,如此培养5-6代后,细胞的所有蛋白质均被同位素标记上。经处理因素刺激后,等量混合各类型蛋白质,然后经SDS-PAGE分离和质谱分析,通过比较一级质谱图中同位素峰型的面积大小进行相对定量,同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。
由于SILAC标记技术是体内标记技术,几乎不影响细胞的功能,更接近样品真实状态。灵敏度更高,定量精确,降低由于样品制备不同而造成的实验差异。但其确定是成本较高。
本公司接受培养好的细胞的后续实验,步骤包括:蛋白提取和样品制备→标记效率测试→样品混合→SDS-PAGE分级→酶解→质谱鉴定→软件分析→定性定量蛋白质组结果→生物信息学数据挖掘和统计分析
SILAC实验流程示意图
样品要求:
蛋白质提取物:浓度>1μg/μl,蛋白质总量 >300μg
细胞样品:细胞量>10
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