在单克隆抗体的生产过程中，由于B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在多样性，必须对杂交瘤细胞群进行第二次筛选，才能选出针对目标抗原具有特异性的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上，使每孔不超过一个细胞，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体的特异性（常用ELISA方法），上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中细胞还不能保证是来自单个细胞，需要继续进行有限稀释，一般重复3－4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞，第二次筛选也是鉴定特异性亲和力的过程。
有限稀释法对于筛选杂交瘤来说，是Z普通的方法，在许多实验室中都在使用。但是，作为相对旧的技术，已经不能满足当今的需求。方法具有许多缺点：
- 人工操作，操作及重复的步骤太多，不可避免容易出错。
- 速度慢，效率低。只能保证30－40％的孔有细胞生长。对于高通量筛选来说，不能满足需求。
- 不能保证单克隆，需要亚克隆3－4次，所以，人工和耗时都较多。
- 有限稀释在ELISA检测前，并不知道哪一个克隆满足抗原特异性的要求。所以，需要对所有克隆，都要Z少做一次ELISA鉴定。
除了有限稀释法，现在相对先进的细胞分选技术也得到普遍应用。一般就是细胞分选仪或者流式细胞技术对杂交瘤细胞进行筛选，其原理是先将细胞分散开，没有细胞结团。通过在细胞表面或细胞内标记荧光信号。当单个细胞在压力作用下单个通过玻璃毛细管的时候，仪器可以自动检测单个细胞的荧光信号强度。荧光信号强度反应这个细胞的相应抗体表达水平。，将高荧光信号强度的细胞收集，再通过有限稀释得到高水平表达的单克隆；或者也可以使用单细胞收集器收集高水平表达的单个杂交瘤细胞。
新一代技术是，甲基纤维素培养基，克隆筛选法。
温馨提示：不可用于临床ZL。
