环氧活化琼脂糖微球FF是将环氧基团键合在琼脂糖微球6FF上冻干形成的一种活性中间体,可直接偶联配基制备分离介质,用于生物大分子的纯化分离。
1.外观
本品为白色球状凝胶,无嗅、无味、无肉眼可见杂质。
2.理化指标
项 目 | 指 标 |
配 基 | 环氧基 |
基 质 | 6%琼脂糖微球 |
颗粒形状及大小 | 球形 50~160 μm |
配基密度 | 20~40μmol环氧基/ml介质 |
流速(25℃) | 300 cm/h |
耐压 | 0.15 MPa |
pH适用范围** | 2~14 |
化学稳定性** | 以下溶液中稳定: 0.1mol/L NaOH; 6mol/L盐酸胍;8mol/L尿素;4 mol/L氯化钠 一般有机溶剂;非离子型表面活性剂 |
*检测条件: 层析柱16mm×300mm *柱床高15cm,25℃, 流动相为0.1mol/LNaCl
**是指偶联配基后的分离介质的性能
3. 包装
产品以聚胺酯瓶密封包装,外贴标签,注明“品名、体积、颗粒大小、保质期、批号、生产日期、生产单位及地址” 等内容。所选用的包装应有利于保证产品质量、方便运输和贮存。
4. 运输
运输中应避免日晒、雨淋、重压,严禁与有毒、有害物品混运。
5. 贮存
冷冻干燥的产品应密封贮存在8℃以下,对于溶胀的偶联后的介质应保存于4℃~8℃的YJ剂(如20%乙醇)里面,通风、干燥、清洁的地方。避免与氧化剂接触。
用过的柱子贮存在4℃(20% 乙醇)。
6.保质期:暂定2年。
7.应用
环氧活化琼脂糖微球FF是将环氧基团键合在琼脂糖微球6FF上冻干形成的一种活性中间体,可直接偶联含氨基、巯基和羟基的配基制备分离介质,用于生物大分子的纯化分离。
下面简要介绍环氧活化琼脂糖微球偶联含氨基配基的使用过程。
7.1干粉的溶胀
称取一定量的环氧活化高流速琼脂糖微球冻干粉,在蒸馏水中悬浮溶胀(1g干粉约溶胀为3~4ml凝胶),放置大约1小时后抽滤,并用约200ml(PH 7)去离子水洗涤干净其中的添加剂,并在漏斗中抽干。
7.2 配基的偶联
一般配基偶联的过程如下:
(1)偶联溶剂:可用去离子水、碳酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。不能用含氨基和其他含亲核试剂的溶液。有时需要有机溶剂溶解配基,如用50%二甲基甲酰胺和二氧六环等。
(2)取一定量的配基溶解到偶联用的缓冲溶液中,使其完全溶解,浓度为200μmol配基/ml凝胶。凝胶与缓冲溶液以1:0.5到1:1的比例混合悬浮反应。
(3)将溶胀的凝胶悬浮到含有配基的缓冲溶液中,在20℃~45℃的水浴中摇荡16小时。也可以用其他搅拌方法使配基偶联,请勿用磁力搅拌。
(4)反应完全后,再洗涤掉缓冲液中的多余的配基。
(5)残余活性基团的消除,将反应完洗涤过的凝胶悬浮到1mol/L乙醇胺(PH 8)的溶液中,在40℃~50℃Z少反应4小时或者室温反应过夜。
(6)在反应完后,用含有0.5mol/LNaCl的0.1mol/L醋酸缓冲液(PH 4.0)和含有0.5mol/LNaCl的偶联缓冲液(PH 8.3)交替洗涤,至少重复以上循环洗涤3次。
7.3 装柱
⑴让所有的材料和试剂达到室温。配制初始缓冲液(平衡液)和洗脱缓冲液。
⑵根据柱子大小取所需量的凝胶,清洗掉溶液,抽干,用初始缓冲液(按凝胶:缓冲液=3:1的比例)配成匀浆。匀浆作脱气处理。
⑶将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位(液面略高于滤膜),务必使底端无气泡。
⑷ 用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内,注意勿使产生气泡。打开柱子出液口,使凝胶在柱内自由沉降,连结好柱子顶端柱头。
⑸打开蠕动泵,让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过,使柱床稳定。用2~3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。
7.4平衡
让平衡缓冲液以一定流速流过柱子,到流出液电导和pH不变。平衡缓冲液一般是根据需要纯化的蛋白来决定用哪种缓冲液。
7.5上样
⑴样品用平衡液配制,浑浊的样品要离心和过滤后上样。
⑵一般情况是让目标产品结合在柱子上,用平衡液洗去杂质,再选择一种洗脱液洗下目标产品。
⑶介质对样品组分吸附的程度取决于介质配基的亲和作用、样品的亲和性质、流动相的组成和温度。
(4)再用缓冲液平衡到流出液电导和pH不变。
7.6洗脱
洗脱液也要根据需要纯化的蛋白决定。
7.7再生
对于使用之后的凝胶,以2~3倍柱体积的0.1mol/L Tris·HCl+0.5mol/L NaCl(PH=8.5)和0.1mol/L NaAc+0.5mol/L NaCl(PH=4.5)依次反复冲洗3~4次,进行再生。
7.8在位清洗
根据偶联的配基选择在位清洗的方法,以洗去柱子污染物同时不伤害柱子为原则。对于一般的污染,用0.1mol/L NaOH进行较长时间的清洗,对配基基本没有的影响;当严重污染后,可用0.5mol/L NaOH 进行短时间的清洗;对于介质中含有其他试剂的,可用含有8 mol/L 尿素和6 mol/L 的盐酸胍的溶液进行在位清洗。若有失活蛋白或脂类物质洗不干净,可用非离子表面活性剂如0.1% Triton洗涤。
清洗完毕后,用至少3倍缓冲液平衡柱子。
7.9注意
在装柱、使用和保存柱子的时候,要避免柱子流干,气泡进入。
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