服务名称:
免疫荧光实验
提供商:
天津津科生物科技有限责任公司
一)目的和原理 免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色),可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。(二)仪器设备 1)湿盒; 2)恒温摇床; 3)荧光显微镜; 4)器械:盖玻片(处理:先下洗液,然后自来水冲洗,纯水冲洗,ddH2O冲洗,烘箱烘干,放入75%的酒精中,使用前挥干酒精)、载玻片、镊子(三)试剂 1)PBS; 2)4%多聚甲醛:PBS配(NaOH调pH值到7.2-7.4),固定细胞; 3)0.2%Triton X-100: PBS配; 4)3%BSA: PBS配; 5)一抗、二抗:均用PBS配; 6)抗淬灭封片剂:试剂公司定购,直接滴加即可(四)操作流程及注意事项 1、贴壁细胞 1) 取出六孔板中已贴壁好的细胞或者加过药的细胞爬片PBS洗三遍,每遍3~5min,每孔2mL。注意:加PBS冲洗不要将细胞冲下来,下面的每一步都应注意这点。此步的时间和次数可以适当减少。
2)4%多聚甲醛室温固定20~40分钟,PBS洗三遍,每遍3~5min,每孔2mL。注意:多聚甲醛固定的时间由细胞状态而定,细胞状态较差,控制固定时间在30min以内,如果状态比较好,可以延长5~10min。
3)0.2%Triton X-100, 4℃(放于冰箱中),透化20~30分钟,PBS洗三遍,每 遍3~5min,每孔2mL。注意:细胞状态较差时,控制时间在15~20左右
4)3%BSA室温封闭1h
5)将盖玻片从6孔板中用针或者镊子挑出,放于载玻片上,有细胞的一面朝上,滴 加一抗100µL~200µL, 4℃湿盒内过夜,也可37℃孵育1小时,前者效果好。注意:有细胞的一面朝上,夹盖玻片的时候小心,不要夹断玻片 6)将盖玻片放回6孔板中,PBS洗三遍,每遍3-5min,每孔2mL。注意:此步的清洗很重要,可以延长清洗时间和清洗次数,可以保证本底比较干净。
7)将盖玻片从6孔板中用针或者镊子挑出,放于载玻片上,有细胞的一面朝上,滴加二抗100µL~200µL,二抗室温1小时(避光),PBS洗三遍,每遍3-5min,每孔2mL。
8)蒸馏水洗掉PBS,抗淬灭封片剂封片,-70℃避光保存。 注意:①还是染完之后没有封片前直接照效果好一些,因为有的时候可能封片会 出现问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会淬灭的。②荧光的 片子一定要避光保存,保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。2、悬浮细胞 1)1000rpm×5min离心收集细胞,PBS洗一次,离心收集 2)-20℃预冷的甲醇100~150µL加入到细胞中,吹匀后快速滴加到6孔板中的盖玻片上,-20℃固定20~30min后,取出挥干甲醇(可以放在空调下吹,或者用电风机吹),尽量保证吹干,但是细胞又都在玻片上。 3)下面的操作同贴壁细胞的3~8步,但是悬浮细胞比贴壁细胞更易吹掉,所以操作时更要小心,尽量保证细胞在玻片上。