服务名称:
酶联免疫吸附试验(ELISA)
提供商:
天津津科生物科技有限责任公司
酶联免疫吸附试验(ELISA)(一)目的和原理 ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的GX催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中,通过不同的设计,具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。(二)仪器设备
1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔; 2) 酶联免疫检测仪; 3) 50μl及100μl加样器,塑料滴头,小毛巾,洗涤瓶; 4)36℃恒温箱,坐标纸等。(三)试剂 1)去离子水 2)ELISA试剂盒(四)操作流程 1)标本收集 (1)收集血液的试管应为一次性的无热源,无内毒素试管 (2 ) 血浆抗凝剂推荐使用EDTA (3 ) 避免使用溶血,高血脂标本 (4 ) 收集标本后若不及时使用,请分装并储存于-20~-70℃ 2)检测前准备工作 (1)提前20分钟取出试剂盒,平衡至室温 (2 ) 将浓缩洗涤用双蒸水稀释(1:20),未用完放回4℃ (3 ) 标准品:加入标准品/标准品稀释液1.0 mL至一支冻干标准品中,静置15分钟,待其溶解,轻微混匀(浓度为1000pg/mL),然后根据需要用量进行稀释 (4 ) 生物素化抗体工作液:按当次实验所需要的用量,使用前20min,以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30) (5)酶结合物工作液:按当次实验所需要的用量,使用前20min,以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物(1:30) 3)洗涤方法 (1)自动洗板机:要求注入的洗涤液为350ul,侏儒语系持股间隔15~30s,洗板5次 (2 ) 手动洗板:甩尽孔内液体,在结晶的吸水纸上拍干,每孔加洗涤液350 ul,静置30秒甩尽液体,在后迭吸水纸上拍干,洗板5次 4)操作步骤 (1)从以平衡至室温的密封袋中取出实验所需板条,未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条,放回4℃ (2 ) 空白孔加标本或标准品稀释液,其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔),用封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱孵育90分钟 (3 ) 提前20分钟准备生物素化抗体工作液 (4 ) 洗板5次 (5)空白孔加生物素化抗体稀释液,其余空加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱孵育60分钟 (6 ) 提前20分钟准备酶结合物工作液,避光室温放置(室温22~25℃) (7) 洗板5次 (8 ) 空白孔加酶结合物稀释液,其余空加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱避光孵育30分钟 (9)打开酶标仪,预热仪器,设置检测程序 (10 ) 洗板5次 (11 )加入显色底物100ul/孔,36℃孵箱避光孵育15分钟 (12 )加入终止液100ul/孔,混匀后即可测量OD450值(3分钟),读数并保存(五)注意事项 1)在使用试剂盒时,从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,维加热至40℃使结晶完全溶解再配制洗涤液。 2)充分混匀对反应结果尤为重要,Z好使用微量振荡器。 3)标准品分装后保存于-20~-70℃,避免反复冻融。