图1. WST-8和WST-8甲攒结构图 图2. CCK-8检测细胞活性原理
产品优势
表1 CCK法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较
检测方法 | MTT法 | XTT法 | WST-1法 | CCK法 |
甲臜产物的水溶性 | 差(需加有机溶剂溶解后再检测) | 好 | 好 | 好 |
产品性状 | 粉末 | 2瓶溶液 | 溶液 | 1瓶溶液 |
使用方法 | 配成溶液后使用 | 现配现用 | 即开即用 | 即开即用 |
检测灵敏度 | 高 | 很高 | 很高 | 高 |
检测时间 | 较长 | 较短 | 较短 | Z短 |
检测波长 | 560-600nm | 420-480nm | 420-480nm | 430-490nm |
细胞毒性 | 高,细胞形态完全消失 | 很低,细胞形态不变 | 很低,细胞形态不变 | 很低,细胞形态不变 |
试剂稳定性 | 一般 | 较差 | 一般 | 很好 |
批量样品检测 | 可以 | 非常适合 | 非常适合 | 非常适合 |
便捷程度 | 一般 | 便捷 | 便捷 | 非常便捷 |
注:1、酚红和血清对CCK法的检测不会造成干扰;
2、本试剂盒细胞毒性非常低,因此加入WST-8显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到测定时间。
毒性测试
1、在96孔板中配置100 μl的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃,5% CO2)。
2、向培养板加入10 μl不同浓度的待测物质。
3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。
4、向每孔加入10 μl CCK溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。
5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
7、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
注:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
细胞活性检测
1、在96孔板中接种细胞悬液(100 μl/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃, 5% CO2)。
2、向每孔加入10 μl CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。
3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
5、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
注意事项
1)建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK试剂后的培养时间。
2)有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加入CCK试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基页面下加,容易产生气泡,会干扰OD值读数。
3)白细胞可能需要培养较长时间。
4)当使用标准96孔板时,贴壁细胞的Z小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK溶液。
5)如果没有450 nm的滤光片,可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片,但是450 nm滤光片的检测灵敏度。
6)培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。
活力计算:
细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100
A(加药):具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0加药):具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力
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