一、技术简介端粒酶是合成染色体末端的端粒的酶。端粒(telomere)是真核细胞染色体的天然末端,由上千个6 碱基重复序列(TTAGGG)组成,是细胞必需的遗传组分,它的作用是维持端粒有足够的长度,保证基因信息在复制过程中的准确性,以防止染色体末端遗传信息的丢失。在正常情况下,每个细胞分裂周期都会使端粒变的越来越短,当端粒短到一定程度时就会发出信号,细胞停止分裂。端粒酶由RNA 和蛋白质亚基组成,是基本的核蛋白逆转录酶,在细胞染色体复制过程中,能够以自身RNA 为模板,在染色体3’末端合成重复序列,维持端粒的长度。端粒酶在正常体细胞中的活性被YZ,但是大量的资料表明在一些恶性肿瘤中的表达高达85%。由于端粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞,并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的。因此,端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。
TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂盒是采用端粒重复序列扩增的方法,利用银染技术检测端粒酶的活性。利用端粒酶在体外可以以其自身RNA 的模板区为模板,在适宜的寡核苷酸链的末端添加6 个碱基的重复序列的特性,采用PCR 方法扩增此重复序列,并进而用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳显示6 个碱基差异的梯带。1994 年Kim 建立的TRAP 法,其主要原理如下:首先合成一个18nt 的TS 做上游引物,端粒酶结合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG,然后每经过一次转位合成一个ggttag 的6 碱基重复序列,端粒酶灭活后,加入CX 做下游引物,经过多次变性-退火-延伸,扩增端粒酶延伸产物。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6 bp的梯状条带,条带的深浅表示端粒酶活性的大小。
二、实验流程1. 端粒酶的提取。
2. PCR 扩增。
3. 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4. 银染。
5. 使用凝胶分析软件进行结果分析。
三、服务说明及结果1. 客户提供:样本材料新鲜或冷冻细胞不少于5×106个,组织样本不少于50mg。
2. 公司提供:PCR扩增图谱、凝胶电泳银染结果图片、数据分析统计结果、实验报告书(包括实验材料、试剂、仪器、实验过程方法、结果及分析)。
3. 实验周期:20-40个工作日(具体视样品数而定)。
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