CRISPR/Cas9 活性检测

利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的gRNA序列是通过各个gRNA设计网站中预测得到的，这些gRNA是否有功能往往需要通过具体的实验验证才能得到，而获得基因编辑的细胞系或小鼠的周期长达几个月甚至半年，因此如何能够快速、准确的验证CRISPR/Cas9系统是否有效成为开展基因功能研究的关键。为此，合生基因提供了多种CRISPR/Cas9功能检测方案：

合生基因开发了可以用荧光蛋白表达情况检测Cas9及gRNA内源活性的检测试剂盒，该试剂盒中荧光报告载体中的荧光报告基因EYFP或mKate被终止密码子提前终止，这种截短型的EYFP或mKate没有活性，为检测gRNA及Cas9活性，可将Cas9/gRNA识别的靶位点插入到终止密码子之后，并在其后加入EYFP或mKate基因的末端序列。在Cas9和gRNA的作用下，靶点位置的双链DNA被切割形成DSB，细胞通过同源重组效应形成有活性的荧光蛋白，可通过荧光显微镜或流式细胞仪来检测荧光强度是否增强来判断Cas9及gRNA的活性及敲除效率。

通过对修饰后的靶序列进行PCR，经变性、退火后，将会形成含有错误配对的DNA双链，将经过错配酶切割后的产物进行凝胶电泳，即可反映出CRISPR/Cas9系统的切割活性。

三、套峰检测法