【DNA显微注射转基因大小鼠制备技术服务】

⑴ 准备假孕鼠：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠，作为受精卵转基因后的代孕鼠；

⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清（PMSG）与绒毛膜促性腺激素（HCG）处理后与可育雄鼠交配，诱导超数排卵。次日从输卵管内收集受精卵备用；断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。

⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因载体导入受精卵雄性原核内。具体操作如下：安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的ZY滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。在高倍镜下，反复吹吸受精卵，使其处于位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，使DNA缓慢流出并控制其流量；直至看到原核膨大即退出。，注射完毕后，放入5% CO2，37CO2培养箱培养。

⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在代孕鼠体内发育成熟。将受体麻醉，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。

⑸对幼鼠的鉴定：

①幼鼠出生1-2周后，自尾部提取DNA，与目的基因引物进行PCR，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；

②建立鼠系，将带有外源基因的大鼠与未经转基因的大鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。

③自大鼠组织中提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。或提取各组织蛋白，进行Western blot鉴定外源蛋白的组织特异性表达差异。


转基因大鼠模型制备： 含基因纯化，自收到委托方菌液后6个月内完成，至少提供3只阳性大鼠（Founder）。

大鼠品系 ： SD大鼠