Real-time PCR技术服务_详细资料

产品信息

服务名称： Real-time PCR技术服务

一．    样品的RNA抽提（Trizol，Invitrogen）
1、样本处理
1）培养细胞：收获细胞 1-5×10 7 ，移入 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol ，混匀，室温静置 5min。
2）组织：每50 - 100mg组织样品，用液氮研磨成粉末，加入1 ml的TRIZOL试剂，混匀，室温静置 5min。

2、两相分离
每1 ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡管体，室温静置 5min。4°C下12,000 ×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

3、RNA沉淀
将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1 ml TRIZOL试剂的此时加0.5 ml的异丙醇。混匀后15到30°C孵育10分钟后，于4°C 12,000 ×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4、RNA清洗
移去上清液，每1 ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4°C 7,500 ×g离心5分钟。

5、重新溶解RNA沉淀
去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5 - 10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A_{260 / 280}比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60°C孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于- 70°C。

二．    RNA浓度与纯度测定
取1μlRNA样品稀释100倍后测定RNA浓度及OD260、OD280。纯的RNAOD260/280在1.8～2.0之间。样品RNA浓度计算公式为：A260 X 稀释倍数×40 ng/ul。

三．    RT（PrimeScript® RT reagent Kit Perfect Real Time，Takara）
1、按下列组份配制RT反应液

5×PrimeScript Buffer

2 μl

PrimeScript® RT Enzyme Mix I

0.5μl

Oligo dT Primer（50 μM）*1

0.5μl

Random 6 mers（100 μM）*1

0.5μl

Total RNA

0.5ng

RNase Free dH2O

Up to 10μl

2、反转录反应条件如下: 37℃ 15 min，85℃ 5 sec。
3、反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。

四．    qPCR（SYBR Premix Ex Taq，Takara）
1、按下列组份分别配制Realtime PCR反应体系。

SYBR Premix Ex Taq

12.5 μl

PCR Forward Primer（10 μM）

0.5 μl

PCR Reverse Primer（10 μM

0.5 μl

DNA模板

1.0 μl

dH2O（灭菌蒸馏水

10.5 μl

Total

25μl

轻弹管底将溶液混合，5000 rpm短暂离心。
2、步骤1配置的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。
95℃，5min；40个PCR循环（95℃，10秒；60℃，20秒；72℃，20秒；79℃，20秒（收集荧光））。
为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，（95℃，2min；60℃，20秒；72℃，20秒；99℃，15秒，并从72℃缓慢加热到99℃（8分钟）。
3、结果与计算
各样品的目的mRNA和内参（GAPDH）分别进行Realtime PCR反应。数据采用2 ^-^△△^CT法进行分析

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Total RNA	0.5ng
RNase Free dH2O	Up to 10μl

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PCR Forward Primer（10 μM）	0.5 μl
PCR Reverse Primer（10 μM	0.5 μl
DNA模板	1.0 μl
dH2O（灭菌蒸馏水	10.5 μl
Total	25μl