是阿留申病病毒(Aleutian Disease Virus，ADV) 会引起阿留申水貂病毒等疾病，会出现精神沉郁，嗜眠，食欲时好时坏，渴欲猛增，抓捕时齿龈易出血，贫血，痉挛，步态蹒踞，共济失调，甚至麻痹。病貂进行性消瘦，濒死前抽搐，排煤焦样便，多死于尿毒症，病程数周、数月不等。剖检以肾脏病变Z明显，肾肿大 2～3 倍，呈现灰色或淡黄色，表面有坏死等症状，对养殖业有巨大危害，因此阿留申病病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的阿留申病病毒染料法荧光定量 PCR 检测试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据阿留申病病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
成 份:250mL 立式盒包装
本产品:3060 250 mL
使用手册:3060sc 1 份
运输及保存 常温运输及保存，有效期二年。
自备试剂 新鲜样品。
使用方法
鼻疽假单胞菌PCR检测试剂盒使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（Z好用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品，则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
9. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。本试剂盒免费赠送 15 次一管式病毒 DNAout，其使用手册可从本公司网站
三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕
后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）：
成分
样品管
N+2 个
PCR 阴性
对照管
PCR 阳性
对照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix
（棕色管）
10 μL 10 μL 各 10 μL
阿留申病病毒 PCR
引物混合液（白盖）
2 μL 2 μL 各 2 μL
自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 待测样品 DNA 模板 6 μL 不加 不加
第 7 步所得 PCR 阳性对照
稀释液（2-7 号）
不加 不加
各 6μL（2 号样到
2 号管，3 号样到 3
号管…）
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪
器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene
3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行
优化）。
过程 温度 时间
预变性 92℃ 5 分钟
PCR 反应
（30 个循环）
92℃ 60 秒
58℃ 60 秒
74℃ 60 秒
13. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，
吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的吸收光谱在 500 nm，发射光
谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵
轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的
log 值，再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等
于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于
30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为
阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则
为阴性，如果小于 40，则为阳性。
二：鼻疽假单胞菌PCR检测试剂盒保存培养细胞、悬浮细胞、细菌和 RNA 病毒
1. 标记收集管。
2. 将待样品转移到离心管中，离心收集细胞，弃上清。注:处理含病毒的样品(如
血浆)可直接从步骤第 4 步开始。
3. 用冰浴的缓冲液洗一次。
4. 将细胞悬浮在少量缓冲液中。
5. 加入五到十倍体积的本产品，混均; 对病毒样品，加入两到三倍体积的本产品，
混均。
6. 将收集管存放于温度适当的地方，存放时间不能超该温度下的Z长存放时间。
如果要存放在-20℃或-80℃，需先在4℃放置过夜后再转移到温度条件(将
样品转移到-20℃或-80℃前，需要倒弃保护液)。注:样品存放温度与其Z长存
放时间关系为如下：
沪公网安备 31011502008050号
