DMEM高糖（不含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、蛋氨酸、胱氨酸） 高校合作商

少数生长缓慢的细菌
　　细胞复苏就是要把原本冷冻保存(冻存)着的细胞恢复到一般的生长状态，今天我们来看看原代细胞的复苏步骤。

　　DMEM高糖（不含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、蛋氨酸、胱氨酸） 高校合作商一、检查

　　收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即处理告诉寄方。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70 °C，隔夜后，移到liq N2)。

　　DMEM高糖（不含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、蛋氨酸、胱氨酸） 高校合作商、冷冻细胞解冻

　　1、依据细胞株说明书指定的基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。

　　绝大多数之细胞均无法立即适应不同基础培养基或不同的血清种类，若因实验需要，必须有所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，方进行所需之实验。若培养液太多时

　　2、 FBS (fetal bovine serum, 胎牛血清), CS (calfserum, 小牛血清)和HS (horseserum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料指定的血清种类培养细胞。

　　DMEM高糖（不含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、蛋氨酸、胱氨酸） 高校合作商3、将培养基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。取出冷冻管，立即放入37 °C 水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后，以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台内。

　　4、依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基，混合均匀，放入37 °C，5 % CO2 培养箱培养。

　DMEM高糖（不含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、蛋氨酸、胱氨酸） 高校合作商　5、对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。在重新冻存sf9细胞前

　　对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO 者，则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，转移至培养瓶中，再放入37 °C， 5 % CO2 培养箱培养。

　　DMEM高糖（不含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、蛋氨酸、胱氨酸） 高校合作商三、收到T25 flask 细胞时的处理方式

　　1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。立即混匀待凝固后倒置于37℃培养18-24小时

　　2. 将原封之T25 flask 静置于37 °C， 5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至37 °C，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。

　　隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。

　　DMEM高糖（不含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、蛋氨酸、胱氨酸） 高校合作商四，细胞复苏注意事项

　　1、整个复苏过程尽量手脚麻利一些，战线拉得太长可能影响复苏效果;

　　2、由于“化冰”这一步里冻存管与水温差太大，尤其是液氮里来的冻存管，放到水里可能会造成翻江倒海的既视感，所以可以用镊子夹住冻存管往水里摁，这样即使有炸裂的情况也会有水做缓冲;

　　3、取冻存管时要谨防冻伤，尤其是夏天，尽管热也Z好穿长袖白大褂，一些不经意的动作可能会把你的小鲜肉“粘”到冰箱门上;原代细胞是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。

　　DMEM高糖（不含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、蛋氨酸、胱氨酸） 高校合作商4、离心这一步也可以在冻存管里的冰融化后直接进行，也就是直接把冻存管离心，离心后弃去原来的冻存液，然后直接加完全培养基重悬细胞，接着把细胞转到培养皿/瓶里培养。这种方法也许不能将DMSO清除得很干净，但是基本影响不大。

　　5、 复苏第二天记得去看看细胞，如果状态还不错的话就说明复苏成功。