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参数规格：

【规格】：96T/48T

【标本】：血清、血浆、细胞上清液、尿液、体液、灌洗液、脑脊髓、心房水、胸房水、组织等。

【特点】：专一性强、灵敏度高、样品易保存、结果易观察、可以定量测定、可以大规模测定样品、仪器和试剂简单。

【运输】：快递(根据客户要求，选择具体的运输方式)

操作流程：

1. 实验前标准品、试剂及样本的准备；

2. 加样（标准品及样本）100μL，37°C孵育1小时；

3. 吸弃，加检测溶液A100μL，37°C孵育1小时；

4. 洗板3次；

5. 加检测溶液B100μL，37°C孵育30分钟；

6. 洗板5次；

7. 加TMB底物90μL，37°C孵育15－25分钟；

8. 加终止液50μL，立即450nm读数。

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工作原理：

将转化生长因子β2 (TGFb2)抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的转化生长因子β2 (TGFb2)与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的转化生长因子β2 (TGFb2)抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成的黄色。颜色的深浅和样品中的转化生长因子β2 (TGFb2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，计算样品浓度。

使用方法：

1、 血清：操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。

2、 血浆：EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、 细胞上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、 组织匀浆：将组织加入适量盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。

5、 保存：如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析：

一.ELISA 标准操作要点

优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm。

1. 标本的采取和保存

大部分ELISA 检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需－20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。

2.加样

加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。

3.保温

在建立ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经

1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。

4.洗涤

洗涤在ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是Z主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。

洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。

洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释，应按要求稀释，所用的水电导率Z好在1.5us/cm 之下，洗液如果结晶应待其融解后配制。保证洗板浸泡时间为40 秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。

5. 显色和比色

TMB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶YZ剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA 结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定。

测读A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，次在Z适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不 移动ELISA 板的位置，测得的A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

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