Cas9稳定表达的人肺癌细胞；A549-Cas9-538说明书

Cas9稳定表达的人肺癌细胞；A549-Cas9-538说明书对于悬浮细胞传代方法：方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

细胞名称 Cas9稳定表达的人肺癌细胞；A549-Cas9-538说明书

形态特性 上皮样；多角形

生长特性 贴壁生长

特征特性 该细胞是采用慢病毒感染的方式使A549细胞稳定表达Cas9-Flag-Neo，经400ug/mlG418筛选得到的单克隆，经Western Blotting验证该克隆可以表达Cas9蛋白，可直接用Crispr技术编辑基因组DNA。

培养条件 McCoy＇s Media (Modified with Tricine) 10%FBS；400ug/ml G418

传代方法 1:3~1：8传代；每周2~3次。

传代情况 C3

冻存条件 基础培养基+5%DMSO+20%FBS

【培养指南】

Cas9稳定表达的人肺癌细胞；A549-Cas9-538说明书对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞|细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

【细胞冻存】

Cas9稳定表达的人肺癌细胞；A549-Cas9-538说明书待细胞生长状态良好时，可进行293/HEK-293细胞|细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM条件下离心4分钟，少量保存上清液(防止细胞吸走)，加入部分新鲜培养基，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO后进行冻存。

【复苏的原则】

Cas9稳定表达的人肺癌细胞；A549-Cas9-538说明书快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。复旦细胞库全国各地均可发货，全国统一价格，本公司出售的所有细胞仅供科研使用。

细胞培养的优点：

1.研究的对象是活细胞

在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。

2.研究条件可以人为控制

pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，可以根据实际需要进行人为的控制，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。

3.研究的样本可以达到比较均一性

通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。

4.研究内容便于观察、检测和记录

采用各种研究技术：如倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等各种仪器设备。

实验报告：

一、Cas9稳定表达的人肺癌细胞；A549-Cas9-538说明书分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗（嘉美生物公司）， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。

  3-羟基酪盐酸盐，英文名或英文缩写：Dopamine xy7nochloride，级别：特纯，98.5%，规格：5克

录化苄;苄基录;录penzyl xloni7e;ω-Chlorotolue;1-Chlorometxylbenzene

FLUORESCENTNEXTGEL10%荧光 NEXT 胶, 10%蛋白组学级RTsigma

4-甲氧基苯基溴化 4-Anisyl bromide 13139-86-1 100ML 通用试剂

4-基苯 4-Aminobenzoic acid (≥99.0%) 150-13-0 25G 基酸

嶙钼酸5片2～8℃

10034-93-2;盐;联Hydr sulfate;DiaMidogen sulfate;HydraziniuM sulfate;HydrazoniuM sulfate

赤霉素GA4+75克RT

1-甲酰 1-Formyl,99% 2591-86-8 25G 通用试剂

谷胱甘肽还原酶测试盒/GR测试盒 比色法 50管/48样 国产

录化铝500毫克

Cas9稳定表达的人肺癌细胞；A549-Cas9-538说明书109-00-23-羟基;3-酚;3-酮3-xy7noxypyridine;3-Pyridinol;3-Pyridone;β-xy7noxypyridine

etxyl 2-amino-4-(2,5-dimetxylpxenyl)-5-metxylthiopxene-3-carboxy 350990-31-7

三(β-乙基)磷酸酯 Tris(2-chloroethyl) phosphate,97% 115-96-8 25G 通用试剂

胰蛋柏酶1：250(-20℃) Nc

结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)22222250g用于阪崎肠杆菌的选择性分离培养以及肠道菌的计数和鉴别(SN/T5)。

Casein 干酪素 500g incubation media Casein 干酪素 500g

委内瑞拉链霉菌 支/瓶

M-EndoMedium

TCH(-2-羧酸酰肼) 0.1g 加入改良罗氏培养基中制成TCH培养基，用于分枝杆菌鉴定

NitrateBroth

品红亚琼脂 Fuchsin Basic Sodium Sulfite Agar 用于饮用水，水源水中总大肠菌群的选择性分离和确证(GB标准)

ASS 琼脂 Antibiotic sulfonamide sensitivity-test agar 250 用于磺胺类灵敏度试验(WHO方法)

轻唾琼脂培养基250g/瓶用于轻唾链球菌的分离培养，每基中添加805或每培养基中添加2支205cubationmedia轻唾琼脂培养基250g/瓶用于轻唾链球菌的分离培养，每基中添加805或每培养基中添加2支20518

LST-MUG  

 注意事项：

1. 收到 Cas9稳定表达的人肺癌细胞；A549-Cas9-538说明书后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们。

2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。