氨基黑染色法胶原纤维染色试剂盒

 产品特点
氨基黑染色法胶原纤维染色试剂盒研究真核基因的Z基础的工作之一就是确定其转录起始位点，目前Z通用的方法是 5′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman发明的、通过 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技术，它在不建立 cDNA 文库的前提下，利用已知 cDNA 序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其 5′-端序列。
本试剂盒就是根据 5′-RACE 原理而开发，它具有下列特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2. 反应条件经过精心优化，包括使用无 RNase H 活性的 MMLV 和优化的引物。
5′-RACE 的原理如下图：

规格及成分
成 分 编 号 十孔盒包装
MMLV 逆转录酶-RI 混合液 10110 20 μL
MMLV Buffer-dNTP 混合液 101105B 60 μL
微量核酸沉淀剂 50903 400 μL
TdT（末端转移酶） 120312 10 μL
2×TdT Buffer（含 dATP） 101105 200 μL
PCR MagicMix 3.0（含染料） 90805B 1mL×2
5′-RACE 引物 A-引物 B 混合液 yw373374 200 μL
5′-RACE 引物 C yw375 200 μL
RNase-Free 水 80403 1 mL
使用手册 101105sc 1 份
工作原理
使用方法 1. 变性模板 RNA：将 1 μg mRNA 或 5 μg 总 RNA 加入到一个 RNase-free 的
塑料管中，补 RNase-Free 水到 10 μL，65℃保温 5 分钟后短暂离心，立即放
冰上待用。如果 RNA 浓度偏低，加 RNase-Free 水之前体积就已经超过 10 μ
L,则需要使用本公司的核酸浓缩剂（需另购,编号为 110801）浓缩到所需的体
积。
2. 在塑料管中按顺序加入：
成分 用量
自备的基因专一性引物A（10 μM） 2 μL
MMLV Buffer-dNTP混合液 6 μL
MMLV逆转录酶-RI混合液 2 μL
3. 37℃保温 60 分钟， 42℃保温 30 分钟， 50℃保温 10 分钟， 75℃保温
10 分钟使逆转录酶变性。短暂离心 5 秒后待用。
4. 在塑料管中加入 40 μL 微量核酸沉淀剂（含不溶的核酸助沉剂，用前需要充分
摇匀再取用），震荡混匀。
5. 室温 12000 rpm 离心 15 分钟，沉淀即为 cDNA。小心吸弃上清。此步沉淀可
以去除多余的 dNTP，否则它们会干扰下步的 TdT 加尾反应。
6. 加入 1mL 自备 75%乙醇，室温 12000 rpm 离心 5 分钟，小心吸弃上清。此
步可以洗去逆转录反应中的盐离子。
7. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体后，晾干后加入 20 μL RNase-free 水，充
分吹打溶解 cDNA 沉淀。注意：为保证加尾效率，溶解 cDNA 的 RNase-free
水Z好不要超过 20 μL。
8. 在两个塑料离心管中按下表设置加尾反应：
成分 样品管 加尾阴性对照管
cDNA溶液（上步所得） 9 μL 9 μL
2×TdT Buffer（含dATP） 10 μL 10 μL
TdT酶 1 μL -（用1 μL水代）
9. 37℃保温 15 分钟进行加尾反应，然后 75℃保温 3 分钟灭活末端转移酶。
在反应管中分别加入 0.5 mL RNase-free 水稀释样品和阴性对照。此 250 倍稀
释液将作为下步 PCR 的模板。
10. 轮 PCR：按下表分别使用不同体积的样品稀释液和阴性对照稀释液做模板
设置 50uL 的 PCR 反应（单位：μL，下表只列出以样品稀释液为模板的反应）。
成分 梯度1 梯度2 梯度3 梯度4
PCR MagicMix 3.0 25 25 25 25
自备基因专一性引物 B（10 μM） 2.5 2.5 2.5 2.5
5′ RACE 引物 A-引物 B 混合液 2.5 2.5 2.5 2.5
样品管稀释液 1 5 10 15
RNase-free 水 19 15 10 5
11. 按下列条件进行 PCR（注：应根据自备引物的 Tm 值选择适当的退火温度，下
面的参数仅仅供参考）。
第 1 次循环：94℃ 5 分，48-52℃ 2 分，72℃ 4 分
第 2-30 次循环：94℃ 40 秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分
延伸：72℃ 15 分
12. 直接取 20μL PCR 产物进行琼脂糖电泳（不需要上样液）检查 PCR 结果(样品
组 4 个样，阴性对照组 4 个样)。如果样品有一条清晰的扩增条带，而阴性对照
在相应的位置没有扩增产物，则可以不做后续的第二轮 PCR，直接进行 DNA
测序或切胶克隆。如样品没有一条清晰的扩增条带，则进入第二轮 PCR。
13. 第二轮 PCR：从 8 管 PCR 产物中各取 1μL 分别加入到 20 μL RNase-free 水
中进行稀释 20 倍，再各取 1 μL 分别作为第二轮 PCR 的模板，共 8 个反应：
成分 用量
轮 PCR 产物的 20 倍稀释液 1 μL
PCR MagicMix 3.0 25 μL
5′ RACE 引物 C 2.5 μL
自备基因专一性引物 C（10 μM） 2.5 μL
RNase-free 水 补至 50 μL
14. 按下列条件进行 PCR：第 1-30 次循环（94℃ 40 秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3
分），延伸：72℃ 15 分
15. 直接取 20μL PCR 产物进行琼脂糖电泳（不需要上样液），一般都会有一个样品
有清晰的条带出现，则可以直接进行 DNA 测序或 TA 克隆。
性能特点
氨基黑染色法胶原纤维染色试剂盒是我公司即用型PCR试剂盒：
运输及保存：低温运输、-20℃保存，有效期一年。
本产品是即用型PCR试剂盒的改良产品， 含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料等所有PCR 所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行PCR 反应，具有广泛的用途。
1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行PCR 实验。
2. 快捷，操作步骤已经限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
3. 本产品A 型含电泳染料，PCR 反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。
4. 由于各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能扩增各种常见的DNA 样品。
5. 产物可直接用于T 载体克隆，不需要额外的加A 反应。
使用及效果：将本产品15 μL 与用户自备的模板，引物和水共15 μL 混合后，直接进行PCR反应（PCR 参数由用户自己确定），反应结束后直接取10 μL 电泳检查扩增结果。
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