Ziehl-Neelsen抗酸杆菌法染色试剂盒

产品及特点：Ziehl-Neelsen抗酸杆菌法染色试剂盒是基于 SP6 RNA 聚合酶的 RNA 体外转录试剂盒，它利用含有SP6 启动子的模版 DNA，以 NTP 为底物，从 SP6 启动子下游开始合成与模版
DNA 中一条链互补的 RNA，简单快速获得大量的 RNA 分子。本产品具有下列
Ziehl-Neelsen抗酸杆菌法染色试剂盒特点：
1. 即开即用，用户只需提供含 SP6 启动子的 DNA 模板即可以进行体外转录实验，不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模版 DNA 可以是线性化的质粒 DNA，也可以是 PCR 扩增产物。
4. 可以合成的 RNA 的长度在 20nt 到 2000 nt 之间。
5. 产品配方经过精心优化，每 ug DNA 模版可以合成 2-6 ug RNA。得到的 RNA 可以用于 RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰（RNAi）等实验。运输及保存 低温运输，-20℃保存, 有效期一年。自备试剂 如果需要去除转录产物中的 DNA 模板，则需要 RNase-free DNase 、Tris 饱和酚、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇（均可从本公司另购）使用方法 一、制备 DNA 模板PCR 片段和质粒 DNA 都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的 DNA。如果是质粒 DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的 DNA 序列的上游必须有 SP6 启动子。如果模板是 PCR 产物，则可以在设计引物时将 SP6 启动子序列（5’ATT TAGGTG ACA CTA TAG AGN G 3’）加上，转录其实是从 3 端 G AGN G 中的个 G 开始。如果是将 DNA 片段克隆到载体上，则需要选择有 SP6启动子的载体，并且克隆位点必须位于 SP6 启动子下游。三是需要转录的DNA 序列的下游端Z好不要是 3’突出。如果是 3’突出（如选择了 Pst I来线性化质粒），则Z好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必须保证 DNA 模板中没有 RNase。由于提取质粒 DNA 的过程中一般要使用大量的 RNase A，因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，Z好采取胶回收得方法回收质粒 DNA。并且加入少量总 RNA 一起保温，然后电泳检测 RNA 是否被降解，以此判断纯化的 DNA 模板是否有残留 RNase A。

二、体外转录反应
1. 在一个 RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在 4℃下）按次序
加入下列成分：
成分 加入量 备注
DNA 模板 X uL
总量在 50 ng-1 ug（如果模板
是 PCR 片段，建议用 50 ng 左
右；如果模板是质粒 DNA，建
议用 1 ug 左右；如果用本产品
提供的阳性对照，建议用 4 uL）
SP6 转录预配液（2×） 10 uL
室温时使用，以免精胺将 DNA
模板沉淀下来
SP6 RNA 聚合酶
混合液
1 uL
本成分还含其他促进剂，所以是
混合物
RNase-free 水 补水到 20 uL
注：此为 20 uL 反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记 RNA 探针，则需要订购 NTP 分开的试剂盒。如果需要得到加帽 RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸（本公司有各种
加帽修饰核苷酸）。
2. 37℃保温 1-2 小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热 10 分钟灭活 SP6 RNA 聚合酶。
4. 取 1-3uL 电泳检测转录效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。
5. 得到的 RNA 可以放-80℃保存。
注：若需进一步去除 DNA 模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，
本试剂盒不提供。
1. 在体外转录体系中加入 3-5 U 自备的 RNase-free DNase（CAT#:90903；
3-5 U/uL）。
2. 37℃保温 15-30 分钟。
3. 补水到 100 uL。
4. 用等体积（100 uL）的 Tris 饱和酚抽提一次去除残留的 DNase 和RNA 聚合酶。
5. 在上清中加 200 uL 自备的微量核酸沉淀剂（CAT#50903；用前需要摇晃混匀），振荡后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。
6. 加入 1 mL 75%乙醇，震荡 10 秒后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。
答客问
1、没有 RNA 产物。Z常见原因是模板有 RNase 污染，可用纯化的 RNA 跟模板 DNA 一起保温，再检测 RNA 是否降解。还可以增加 RNase Inhibitor用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase污染严重，可能需要用户补加 RNase inhibitor。
2、RNA 产量低。Z常见的原因是 DNA 模板。在转录序列的个和第二个碱基Z好都是 G，在前 14 个碱基内避免有 U 存在。
3、RNA 长度比预期的短。可能是模板序列中有 SP6 RNA 聚合酶的终止序列。可以改用 SP6 体外转录试剂盒（启动子也必须改成 SP6 启动子）。
4、RNA 长度比预计的长。SP6 RNA 聚合酶跟 Taq DNA 聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，Z多有一半的 RNA 可以带一个或两个碱基的尾巴。如果 RNA 长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒 DNA，则可能是质粒DNA 线性化不彻底。
5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用 GTP，则得到的 RNA 是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如 12 小时），则有 50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入 GMP，则 SP6 RNA 聚合酶将优先使用 GMP，所得RNA 产物中 5’端是单磷酸的比例将大大增加。
6、如何得到带帽 RNA？需加入带帽 NTP 类似物即可，本公司提供 5 种供选择
（产品编号 130694-130698）。
Ziehl-Neelsen抗酸杆菌法染色试剂盒关联产品 T7 体外转录试剂盒（CAT#:91106）、T3 体外转录试剂盒（CAT#:91108）