Spicer高铁二胺染色法粘多糖染色试剂盒

产品及特点：Spicer高铁二胺染色法粘多糖染色试剂盒是基于 SP6 RNA 聚合酶的 RNA 体外转录试剂盒，它利用含有SP6 启动子的模版 DNA，以 NTP 为底物，从 SP6 启动子下游开始合成与模版
DNA 中一条链互补的 RNA，简单快速获得大量的 RNA 分子。本产品具有下列
Spicer高铁二胺染色法粘多糖染色试剂盒特点：
1. 即开即用，用户只需提供含 SP6 启动子的 DNA 模板即可以进行体外转录实验，不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模版 DNA 可以是线性化的质粒 DNA，也可以是 PCR 扩增产物。
4. 可以合成的 RNA 的长度在 20nt 到 2000 nt 之间。
5. 产品配方经过精心优化，每 ug DNA 模版可以合成 2-6 ug RNA。得到的 RNA 可以用于 RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰（RNAi）等实验。运输及保存 低温运输，-20℃保存, 有效期一年。自备试剂 如果需要去除转录产物中的 DNA 模板，则需要 RNase-free DNase 、Tris 饱和酚、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇（均可从本公司另购）使用方法 一、制备 DNA 模板PCR 片段和质粒 DNA 都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的 DNA。如果是质粒 DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的 DNA 序列的上游必须有 SP6 启动子。如果模板是 PCR 产物，则可以在设计引物时将 SP6 启动子序列（5’ATT TAGGTG ACA CTA TAG AGN G 3’）加上，转录其实是从 3 端 G AGN G 中的个 G 开始。如果是将 DNA 片段克隆到载体上，则需要选择有 SP6启动子的载体，并且克隆位点必须位于 SP6 启动子下游。三是需要转录的DNA 序列的下游端Z好不要是 3’突出。如果是 3’突出（如选择了 Pst I来线性化质粒），则Z好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必须保证 DNA 模板中没有 RNase。由于提取质粒 DNA 的过程中一般要使用大量的 RNase A，因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，Z好采取胶回收得方法回收质粒 DNA。并且加入少量总 RNA 一起保温，然后电泳检测 RNA 是否被降解，以此判断纯化的 DNA 模板是否有残留 RNase A。

二、体外转录反应
1. 在一个 RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在 4℃下）按次序
加入下列成分：
成分 加入量 备注
DNA 模板 X uL
总量在 50 ng-1 ug（如果模板
是 PCR 片段，建议用 50 ng 左
右；如果模板是质粒 DNA，建
议用 1 ug 左右；如果用本产品
提供的阳性对照，建议用 4 uL）
SP6 转录预配液（2×） 10 uL
室温时使用，以免精胺将 DNA
模板沉淀下来
SP6 RNA 聚合酶
混合液
1 uL
本成分还含其他促进剂，所以是
混合物
RNase-free 水 补水到 20 uL
注：此为 20 uL 反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记 RNA 探针，则需要订购 NTP 分开的试剂盒。如果需要得到加帽 RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸（本公司有各种
加帽修饰核苷酸）。
2. 37℃保温 1-2 小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热 10 分钟灭活 SP6 RNA 聚合酶。
4. 取 1-3uL 电泳检测转录效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。
5. 得到的 RNA 可以放-80℃保存。
注：若需进一步去除 DNA 模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，
本试剂盒不提供。
1. 在体外转录体系中加入 3-5 U 自备的 RNase-free DNase（CAT#:90903；
3-5 U/uL）。
2. 37℃保温 15-30 分钟。
3. 补水到 100 uL。
4. 用等体积（100 uL）的 Tris 饱和酚-抽提一次去除残留的 DNase 和RNA 聚合酶。
5. 在上清中加 200 uL 自备的微量核酸沉淀剂（CAT#50903；用前需要摇晃混匀），振荡后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。
6. 加入 1 mL 75%乙醇，震荡 10 秒后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。
答客问
1、没有 RNA 产物。Z常见原因是模板有 RNase 污染，可用纯化的 RNA 跟模板 DNA 一起保温，再检测 RNA 是否降解。还可以增加 RNase Inhibitor用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase污染严重，可能需要用户补加 RNase inhibitor。
2、RNA 产量低。Z常见的原因是 DNA 模板。在转录序列的个和第二个碱基Z好都是 G，在前 14 个碱基内避免有 U 存在。
3、RNA 长度比预期的短。可能是模板序列中有 SP6 RNA 聚合酶的终止序列。可以改用 SP6 体外转录试剂盒（启动子也必须改成 SP6 启动子）。
4、RNA 长度比预计的长。SP6 RNA 聚合酶跟 Taq DNA 聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，Z多有一半的 RNA 可以带一个或两个碱基的尾巴。如果 RNA 长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒 DNA，则可能是质粒DNA 线性化不彻底。
5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用 GTP，则得到的 RNA 是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如 12 小时），则有 50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入 GMP，则 SP6 RNA 聚合酶将优先使用 GMP，所得RNA 产物中 5’端是单磷酸的比例将大大增加。
6、如何得到带帽 RNA？需加入带帽 NTP 类似物即可，本公司提供 5 种供选择
（产品编号 130694-130698）。
Spicer高铁二胺染色法粘多糖染色试剂盒关联产品 T7 体外转录试剂盒（CAT#:91106）、T3 体外转录试剂盒（CAT#:91108）