罗丹明标记鬼笔环肽供应

名称：罗丹明标记鬼笔环肽供应
品Pai：百奥莱博
规格：300T
产地：国产|进口
编号：QN0267
本品为TRITC标记的鬼笔环肽，染色反应特异性强，对比性高，具有比Actin抗体更好的染色效果，适合用作F-actin的定性和定量检测。另外，经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。

别名：罗丹明鬼笔环肽
分子式：C60H70N12O13S2
分子量：1231.4
性状：紫色粉末(冻干粉)

鬼笔环肽(Phalloidin)是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏的环状七肽毒素，以高亲和力(Kd= 20 nM)选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体系中的F-actin，从而对F-actin进行定性和定量分析。另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白(Actin)抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未标记肌动蛋白(Actin)的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能发生反应;鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质;以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。

鬼笔环肽(Phalloidin)的结合阻止丝状肌动蛋白(微丝)的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度(CC)降至＜1µg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还可YZF-actin的ATP水解活性。

1. 工作液准备
本品以溶于甲醇的 20µM 储存液形式提供，总量为 300µl。按照 100 nM 的工作液浓度来换算，可制备总量为 60ml 的工作液。建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。开始实 验前，使用 1×PBS 缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80~200nM。现配现用。

2. 染色步骤
1) 细胞爬片生长 24h，使其密度达到 50%汇合度。
2) 吸掉培养液，37℃预热的 1×PBS(pH 7.4)清洗细胞 2 次。
3) 使用溶于 PBS 的 4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定 10min。 注意：避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。
4) 室温条件下，用 PBS 清洗细胞 2~3 次，每次 10min。
5) 室温条件下，用丙酮(≤-20℃)脱水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化处理 5min。
6) 室温条件下，用 PBS 清洗细胞 2~3 次，每次 10min。
7) 取 200µl 配制好的 TRITC 标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育 30min(通常情况下， 4℃~37℃孵育皆可)。 注意：为了降低背景，可于 TRITC 标记的鬼笔环肽工作液内加入 1% BSA;另外，孵育过程中为了避免溶液挥 发，可将盖玻片转移到一个密封的容器内。
8) 用 PBS 清洗盖玻片 3 次，每次 5min。
9) 使用 200µl DAPI 溶液(浓度：100 nM)对细胞核进行复染，约 30s。
10) 用 PBS 清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫 掉多余封片剂，然后用指甲油封片。此法制备的标本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 个月内可继续做 F-actin 染色分析。 注意：也可以直接使用含有 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂合并步骤 9)10)，简化步骤。
11) 荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择 TRITC 激发/发射滤片(Ex/Em=540/570nm)和 DAPI 激 发/发射滤片(Ex/Em=364/454nm)。

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