5×非变性蛋白上样缓冲液 蛋白质研究

名称：5×非变性蛋白上样缓冲液 蛋白质研究
产地：国产|进口
规格：2ml
编号：SY0350
品Pai：百奥莱博
本品用于常规的非变性聚丙烯酰胺（PAGE）蛋白电泳样品上样。5×非变性蛋白上样缓冲液(Non-denatured Gel Sample Loading Buffer)是一种经过改良的以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的蛋白上样缓冲液。产品中不含有SDS等变性试剂，但是含有还原性试剂DTT。


注意事项
1)为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2)5×非变性蛋白上样缓冲液中含少量DTT，有轻微刺激性气味，但不含剧毒的巯基乙醇。

操作方法
1.在室温或不超过37℃的水浴中溶解5×非变性蛋白上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放，尽量避免长时间置于水浴中。
2.按照每4 μl蛋白样品加入1 μl 5×非变性蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和5×非变性蛋白上样缓冲液。
3.直接上样到PAGE胶加样孔内即可。
4.通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

储存条件：-20℃，有效期一年。

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·通用型全血PCR试剂盒
编号：SY0050
英文名称：Animal Blood Direct PCR Kit
规格：50T
全血直接PCR试剂盒（Blood direct PCR Kit）可以直接对全血样本进行PCR，无需进行DNA纯化或样品预处理，大大降低了污染风险，缩短时间和节约支出。

试剂盒中包含配方优化的2×Blood Buffer，而血液DNA聚合酶专为全血DNA直接扩增而设计，对全血样品中的PCRYZ剂具有的抵抗力，可扩增全血浓度高达40%。高度优化的反应体系使得Blood direct PCR Kit能够从全血样品中GX扩增长达10 kb的基因组片段。扩增产物为平端，适用于速克隆试剂盒。另外，试剂盒中配有与哺乳动物和其他许多脊椎动物兼容的引物预混液Positive control primer mix，可用于进行阳性对照反应。

该试剂盒可用于直接扩增的血样类型包括：新鲜血液、4℃贮存血液、冷冻血液以及储存在Whatman 903和FTA商用卡上的干血渍，且兼容所有常规抗凝剂 (EDTA、柠檬酸盐、肝素等)。Blood Direct PCR Kit已经在许多哺乳动物物种上进行了成功测试，并成功扩增了几种禽类全血。

产品组份：

组分	50T	200T
Blood Super-Fidelity DNA Polymerase（1U/μl）	75 µl	300 µl
2×Blood Buffer	1.25 ml	1.25 ml×4
Positive control primer mix (10 μM each)	50 µl	50 µl
10 mM each dNTPs	50 µl	200 µl
10×Loading buffer	1.25 ml	1.25 ml

储存条件：-20℃。

质量控制：50 μl PCR体系中，以5 μl人全血为模板扩增7.5 kb片段。35个循环后将1/10 PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的7.5 kb条带。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）推荐血液模板使用量为反应总体积的1/10，即50 μl的反应体系内加入5 μl全血。
3）吸取抗凝血，尤其是长期存放过的抗凝血时，应尽量避免吸取血液凝块。
4）延伸时间按30 sec/kb设定，如不足15 sec，设置15 sec即可。超过5 kb片段扩展时，如发现扩增效率较低，可适当延长延伸时间至60 sec/kb。
5）PCR完成后，推荐将反应液于1,000×g (大约4,000 rpm) 离心1～3 min以沉淀血细胞碎片，之后取上清进行下游分析。

操作方法

1. 反应体系配制：
所有组分解冻后请充分摇匀，使用完毕后及时放回-20℃。

ddH2O	Up to 50 μl
引物1 (10 μM) a	2 μl
引物2 (10 μM) a	2 μl
10 mM each dNTPs	1 μl
2×Blood Buffer c	25 μl
全血b	5 μl
Blood Super-Fidelity DNA Polymerase（1U/μl）d	1.5 μl

a. 推荐每条引物使用终浓度为0.4 μM，引物使用量太多会导致非特异性扩增增加。
b. Z适全血模板浓度范围为1%～20%，推荐使用10%作为初始尝试条件，尽量避免吸取血液凝块。如果样本是贮存在Whatman滤纸卡上的干血渍，则可取约1mm2带血渍的圆纸片，将其直接放入PCR反应液中，无需预处理。
注1：对于禽类和血细胞中带细胞核的其他物种，可能需要减少用于PCR反应的血量。
注2：全血若短期贮存 (少于3个月)，可置于4℃；若长期贮存，推荐存于-20℃或者Whatman FTA/903卡上。
c. 对于使用全血模板的大多数PCR反应，Mg2+终浓度为2 mM。2×Blood Buffer已含有终浓度为2.0 mM 的Mg2+。但Mg2+的浓度会随引物、反应中的血液浓度和所用贮存卡的种类的不同而改变。如推荐反应体系无法正常扩增时，可用25 mM MgSO4，以0.2-0.5 mM为间隔向上摸索Mg2+使用浓度。
d. Blood Super-Fidelity DNA Polymerase是一种带有校对活性的高保真聚合酶，其保真度是普通Taq聚合酶的52倍。该酶中添加了可以在常温下封闭其外切酶和聚合酶活性的单克隆抗体，可进行高特异性的热启动PCR。
注1：Blood Super-Fidelity DNA Polymerase具有较强的校对活性，扩增产物为平末端。如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化。
注2：提高酶的使用量有助于扩增产量的提高，但请勿超过2 U/50 μl。
2. PCR反应条件设置

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性a	95℃	5 min	1
变性	95℃	15 sec	35d
退火b	56℃～72℃	15 sec
延伸c	72℃	30 sec/kb
彻底延伸	72℃	5 min	1

a. 预变性(95℃，5min)可以让白细胞裂解，释放可用于PCR扩增的基因组DNA。 请勿缩短时间或降低温度。
b. Blood Super-Fidelity DNA Polymerase能够促进模板和引物GX退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值即可。然而，使用高的退火温度可以有效减少非特异性扩增，并提高全血模版的扩增效率。因此，如扩增产物特异性较差，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板Z适退火温度。推荐退火时间设置为15 sec即可。
c. 延伸时间按30 sec/kb设定，如不足15 sec，设置15 sec即可。超过5 kb片段扩展时，如发现扩增效率较低，可适当延长延伸时间至60 sec/kb。
d. 一般而言，35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加，且有可能会降低扩增保真度。
注：如退火温度高于68℃，可将退火过程和延伸过程合并，进行两步法PCR。温度设定为退火温度(如高于72℃，则设置为72℃即可)，时间设置为30 sec/kb。
3. 扩增产物分析

PCR完成后，建议将反应液于1000×g (大约4000rpm) 离心1～3 min以沉淀血细胞碎片，之后取上清进行下游分析。该步骤可有效去除多种血液组分。当使用高浓度血液模板时此步尤为重要，因为经过PCR循环，反应管中会存在大量的血细胞碎片。这些碎片会干扰下游的检测，如琼脂糖电泳检测。若需对PCR产物进行酶切分析(PCR-RFLP)，应预先将其稀释2～4倍，以去除存在于PCR反应液中的盐及其它YZ剂对酶切反应的干扰。

4. 对照反应

试剂盒中提供引物预混液Positive control primer mix(10 μM each)用于阳性对照反应。可从哺乳动物及其他许多脊椎动物的基因组中扩增237 bp的片段。该扩增区位于sox21基因的上游，是一段高度保守的非编码区。
Primer #1 (24-mer) 5’- AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG -3’
Tm: 69.5℃(S=G or C)，使用Primer Premier 5 计算。
Primer #2 (27-mer) 5’- GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA -3’
Tm: 67.9℃ (R=A)，71.5℃ (R=G)，使用Primer Premier 5 计算。
4.1 反应体系

ddH2O	Up to 50 μl
Positive control primer mix (10 μM each)	2 μl
10 mM each dNTPs	1 μl
2×Blood Buffer	25 μl
全血	5 μl
Blood Super-Fidelity DNA Polymerase（1U/μl）	1.5 μl

4.2 PCR反应条件设置

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	15 sec	35
退火	68℃	15 sec
延伸	72℃	15 sec
彻底延伸	72℃	5 min	1

全血扩增引物设计注意事项

1）引物3’端一个碱基选择C或G；
2）引物3’端8个碱基应避免出现连续错配；
3）引物3’端尽量避免出现发夹结构；
4）引物Tm值控制在60℃-72℃之间 (推荐使用软件Primer Premier 5进行计算)；
5）引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；
6）引物GC含量控制在40%-60%之间；
7）正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。


5×非变性蛋白上样缓冲液 蛋白质研究