高特异性大鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)ELISA试剂盒公司报价实验原理ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被,加待测抗原(抗体),再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。
一、高特异性大鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)elisa试剂盒公司报价实验原理
ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被,加待测抗原(抗体),再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。
二、ELISA试剂盒组成
1. 微孔板 (固相抗体) 96 well
2. 标记抗体 (30倍浓缩,HRP标记抗体) 0.4 ml
3. 标准品 0.5 ml × 2
4. EIA缓冲液 (1% BSA, 0.05% Tween-20 含有PBS) 30 ml
5. 标记抗体稀释液 (1% BSA, 0.05% Tween-20 含有PBS) 12 ml
6. 显色液 (TMB底物液) 15 ml
7. 终止液 (1N硫酸) 12 ml
8. 洗涤缓冲浓缩液 (40倍浓缩,0.05% Tween-20的磷酸缓冲液) 50 ml
备注:标准品用标准品稀释液依次稀释为:200、100、50、25、12.5、6.25ng/ml
三、ELISA法的应用
1.免疫酶染色各种细胞内成分的定位。
2.研究抗酶抗体的合成。
3.显现微量的免疫沉淀反应。
4.定量检测体液中抗原或抗体成分。
四、性能
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。
2.批内与批见应分别小于9%和11%
五、检测范围和保存条件及有效期
1.试剂盒保存:2-8℃
2.有效期:6个月
六、高特异性大鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)ELISA试剂盒公司报价操作步骤
1、准备:从冰箱取出试剂盒,室温复温平衡30分钟。
2、配液:用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
3、加标准品和待测样本:取足够数量的酶标包被板,固定于框架上,分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔,记录各孔位置,在标准品孔中加入标准品50μL;待测样本孔中先加入待测样本10μL,再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍);空白对照孔不加。
4、温育:37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5、洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
6、加酶标工作液:每孔加入酶标工作液50μL,空白对照孔不加。
7、温育:重复4的操作。
8、洗板:重复5的操作。
9、显色:每孔先加入显色剂A 液50μL,再加入显色剂B液 50μL,37℃避光显色15min。
10、终止:取出酶标板,每孔加终止液50μL,终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。
11、测定:以空白孔调零,在终止后15分钟内,用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。
12、计算:根据标准品的浓度及对应的OD值,计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样本的OD值,在回归方程上计算出对应的样品浓度,也可以使用各种应用软件来计算。浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。
七、ELISA的标准曲线拟合
一般情况按照说明书推荐方法拟合标准曲线。标准曲线可以由酶标仪附带软件自动生成,也可手动制作。标准曲线呈“S”形曲线,两端趋于水平,中间趋于线性,中间部分为较佳的检测范围。当标准品的量超过与包被抗体结合的量,此时标准品已饱和,再增加标准品的量,其OD值不再变化,故当标准品达到一定浓度后,曲线就趋于水平。一般厂商给出的浓度范围落在中间线性范围,根据标准曲线,可以测出样本的浓度。按照科学分析方法,如果存在“奇异点”或者“污点”,直接采用线性分析不是很好,要对拟合标准曲线的几个点进行取舍,同时也可改用双对数直线拟合或者四因素曲线拟合。
八、高特异性大鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)ELISA试剂盒公司报价标本的采取和保存
血清:是Z常用于ELISA检测的一类样本,处理也比较简单。
用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本,将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜,使血清析出。(Z好将试管或离心管倾斜放置,使液面横截面增大,能使血清更大程度的析出。)4℃1000×g离心20min,仔细收集上清。建议将血清分装多份,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。
采血过程中应避免溶血,因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质,在以HRP为标记的ELISA检测中会有非特异性的显色,而导致检测的不准确性。同时也应避免细菌污染,因为菌体内可能含有内源性的HRP从而导致检测的假阳性。
血浆:用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本,标本采集后30min内4℃1000×g离心15min,取上清即血浆。将上清分装多份,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。
九、ELISA试剂盒操作中的洗涤
a)洗液不要溢出孔外,以免污染相邻的孔,特别是每次洗板的前两遍,若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔,其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,背景肯定会ZG。
b)特别注意:设计实验的时候要考虑实验孔的位置,保证甩掉洗液时,空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开Z好。同时注意甩掉洗液的动作翻转(从正上方旋转120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体!甩出后以直线方式补2-3次甩出液体。
c)用干净的滤纸,不要用卫生纸,因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底,导致洗板不干净,结果偏高或偏低,重复孔的数值也会相差很大。
d)每次拍板不要重复在一个地方拍,特别是洗去酶的步骤;拍板不宜过轻,否则拍不干净,拍板很用力不会对蛋白有什么影响。但注意不要太重,以至把板条给拍断。每次洗板后轻叩几下,一次一定要扣干净。
e)不能减少洗液体积、洗板时间和次数。洗板时间太短,洗板效果不佳。延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景更干净。
十、关于操作过程中的提示:
⑴严格按照试剂说明书进行操作。操作前将试剂在室温下平衡30~60min。
⑵加样后及时放人孵箱。标本较多时,要分批操作。按说明步骤严格控制操作时间,防止孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底。
(3)封板温育时,各孔一定要封严,防止阳性标本的液体蒸发,产生周边现象从而导致“花板”的出现。
(4)用洗板机洗板时,保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板后Z好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干:还要防止针口有纤维蛋白或异物,这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。
(5)合理安排检测量,以免反应板过多造成洗板等待时间长。
(6)加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
(7)显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。
(8)加样时保持显色剂不外流;A、B液应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。
(9)应保证C清洁,整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至限度。从而提高检测的特异性。并得到更准确、可靠的实验结果。
十一、计算
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
十二、高特异性大鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)ELISA试剂盒公司报价实验要点
洗涤:洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外,手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种,过程如下:
(1)浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液;b.用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去);c.浸泡,即将洗涤液注满板孔,放置1-2分钟,间歇摇动,浸泡时间不可随意缩短;d.吸干孔内液体。吸干应彻底,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;e.重复操作c和d,洗涤3-4次(或按说明规定)。在间接法中如本底较高,可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20,其浓度可在0.05%-0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
(2)流水冲洗式 流水冲洗法Z初用于小珠载体的洗涤,洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置,使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗,持续冲洗2分钟后,吸干液体,再用蒸馏水浸泡2分钟,吸干即可。浸泡式犹如盆浴,流水冲洗式则好比淋浴,其洗涤效果更为彻底,且也简便、快速。已有实验表明,流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压,让水流冲击板孔表面,洗涤效果更佳。
十三、高特异性大鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)ELISA试剂盒公司报价常见问题与答案
问:ELISA试验的标准曲线和测定的重复性差,这是什么原因造成的?
答:ELISA试验的标准曲线和测定的重复性差,这是典型的由测定操作引起的问题,常见原因如下:
a)可能原因:ELISA加样本及试剂量不准;孔间不一致;
解决方法:校正移液器,吸嘴要配套,装吸嘴时要紧密。
重复某一样品时,加样时间尽可能与次接近;
重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性;
样品稀释前应充分混匀。
b)可能原因:加样过快,孔间发生污染;
解决方法:重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性;加样不要过快。
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