猪流行性腹泻病毒+猪传染性胃肠炎病毒一步法RT-PCR诊断试剂盒厂家直销

名称：猪流行性腹泻病毒+猪传染性胃肠炎病毒一步法RT-PCR诊断试剂盒厂家直销
产地：国产|进口
品Pai：百奥莱博
编号：DL086
规格：20次
【注意】接到货后请认真阅读注意事项。
【用途】用于猪流行性腹泻病毒病的检测、诊断和流行病学调查。
【试剂】
编号 数量 保存
SR-I 4mL 4℃
SR-II 10mL 4℃
SR-Ⅲ 14mL 4℃
TU-1 1.5mL 4℃
TU-2 0.8mL 4℃
TU-3 250uL -20℃
TU-4 20uL -20℃
TU-5 20uL -20℃
TU-6 20uL -20℃
TU-7 60uL -20℃
TU-8 25uL -20℃
TU-9 20uL -20℃
TU-10 20uL -20℃
T 500uL -20℃
【操作步骤】
1.RNA提取 
(1) 取疑似病料（空肠、小肠及其内容物等），用Hank’s液或PBS研磨成1：3悬液，在－20 ℃反复冻融3次，经3 000 r/min离心5 分钟，上清液再经12 000 r/min离心15分钟，上清液－70 ℃保存备用。
（2）取200uL上清液（或标准品Ｔ），移入新的1.5mL灭菌EP管中，加入200uLSR-I，漩涡振荡混合均匀，静置5min。
（3）加75uL TU-1，漩涡振荡混合均匀，10000r/min离心5 min。
（4）将上清转移到新的2 ml离心管（试剂盒内提供）中，加入300 uL 异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6-8次，混合均匀。
（5）将步骤4中的混合液移入制备管中，并将制备管置于同一2 ml离心管，10000 r/min离心1min。
（6）弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，加500 uL SR-II，室温静置1min，10000 r/min离心1 min。
（7）弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，加700 uL SR-Ⅲ，10000 r/min离心1 min。
（8）将制备管置回到2 ml离心管中，10000 r/min离心1 min。
（9） 将制备管置于洁净的1.5 ml离心管中（试剂盒内提供），在制备管膜ZY加40 uL TU-2， 室温静置1 min。10000 r/min离心1 min洗脱。洗脱液即为模板，即用或-70℃冻存备用。
2.One-Step RT- PCR加样体系
TU-3 12.5uL
TU-4 1uL
TU-5 1uL
TU-6 1uL
TU-9 1uL
TU-10 1uL
模 板 7.5uL 
3.反应程序 
第1步 50℃ 45min  
第2步
第3步 94℃预变性
94℃变性 5min
1min  
第4步 53℃退火 1min 30个循环（3～5步）
第5步 72℃延伸 1min  
第6步 72℃延伸 6min  
第7步 4℃终止 5min  
4.电泳
配制1%琼脂糖凝胶，取PCR产物5uL混合1uL TU-8，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加3uLTU-7，在120v 电压下，1×TAE液中电泳15分钟，在紫外成像仪下观察结果。
【结果判定】
在约720bp位置出现扩增带，猪传染性胃肠炎检测结果为阳性，在约240bp位置出现扩增带，猪流行性腹泻检测结果为阳性。                             
1.DL2000 Marker
2.标准阳性片段

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