双切口酶系统 Sigma-Aldrich 代谢组学

继ZFN（Zinc Finger Nucleases）技术后，Merck在2013年推出新一代基因组编辑工具--CRISPR/Cas9，让研究人员以更快、更经济的方式实现基因组特定位点的编辑。凭借过去10年在基因组编辑领域的丰富经验积累以及专业的生物信息学平台，Merck已经成功设计出覆盖人类，小鼠和大鼠三个物种的所有基因的CRISPR/Cas9载体，并可以提供在线定制服务，以及完整的CRISPR实验workflow解决方案。此外，默克与Sanger Institute合作开发了人、小鼠全基因组CRISPR 文库，以帮助科学家实现基因功能的快速筛选、规模化的模型建立以及药物作用筛选等。

• GX：优化的载体设计，限度提高转染效率，简化筛选工作
• 特异：特殊的gRNA设计和双切口酶系统，限度提高特异性
• 全面：产品齐全，可提供质粒、RNA、慢病毒载体、RNP等形式，涵盖人、大鼠、小鼠、植物等多个物种，更有Sanger Arrayed和Broad Pools全基因组文库以及重要通路的亚文库
• 掌控：强大的慢病毒全基因组文库可轻松进行高通量筛选，全面掌控人或小鼠的基因组

CRISPR/Cas9 基因编辑工具

• Sanger Arrayed Lentiviral CRISPR   Libraries • Lentiviral CRISPR Pools Libraries • CRISPR/Cas9单载体表达系统 • CRISPR Cas9-D10A双切口酶系统 • SygRNA® Cas9 RNP系统 • CRISPR/Cas9基因激活表达载体 • CRISPR/Cas9在植物中的应用 • Cas9蛋白 • CRISPR对照 (DNA and Virus)

CAS9D10AP Sigma

别名: CAS9D10A 质粒

• 性质

Components

1管含1μg 的Cas9-D10A 切口酶质粒。

请注意，该产品不含向导RNA序列。向导RNA必须通过定制CRISPR产品选项卡单独购买。

Preparation Note

Sigma CRISPR质粒产品为小量提取包装，可能不适用于转染到特殊类型的细胞中。为得到佳结果，我们建议在转染前使用无内毒素的DNA纯化试剂盒大量提取质粒。

Physical form

Sigma Cas9-D10A切口酶质粒的产品形式是浓度为20ng/μl的50µl溶液。

Application

功能性基因组学/靶点验证 

• 在多种细胞系中进行基因敲除
• 对不适合于RNAi的基因进行完全敲除
• 建立基因敲入细胞系，将启动子、融合标签或报告基因整合到内源性基因中

   

  Features and Benefits

  Cas9-D10A单个载体的应用可延伸至所有U6-向导RNA质粒。为优化Cas9与向导RNA的比例，可改变Cas9和向导RNA的用量。新证据表明，CRISPR内切酶的脱靶效应是一个重要问题。为了解决这一问题，Sigma开发的配对切口酶技术可将CRISPR DNA识别域的长度延长至与ZFN和TALEN相近。我们的经验表明，基于Cas9-D10A突变体的配对切口酶是Z可靠的。我们的开发工作也证明，产生活性配对切口酶的关键因素在于gRNA在5’至5’方向上的定位。对于配对CRISPR切口酶质粒的递送，我们建议使用由Cas9-D10A 表达载体和2个U6驱动型gRNA组成的三元系统。为了简化配对切口酶的使用，可通过Sigma的在线工具进入预设计配对切口酶库。请查看Sigma在线CRISPR产品，获取新设计方案集。

  Principle

  CRISPR/Cas是细菌和古细菌的一种防御系统，可用来对抗入侵的病毒和质粒。来自酿脓链球菌的II型CRISPR/Cas系统包含两种分子元件，即一个Cas9蛋白和一个非编码向导RNA（gRNA），该系统经过基因改造而被用于真核系统中。Cas9核酸内切酶可在单个gRNA的引导下，在指定基因组位置上引入DNA双链断裂（DSB）。与锌指核酸酶（ZFN）诱导的DSB相似，细胞随后会激活内源性DNA修复程序，即非同源性末端接合（NHEJ）或同源重组修复机制（HDR），对目标DSB进行修复。

  General description

  CRISPR Cas9-D10A切口酶表达质粒使用CMV启动子，可获得较强的Cas9瞬时表达。您可以使用MluI和NheI酶切将CMV替换为其它启动子。同时，使用XbaI酶切可使Cas9-D10A表达质粒线性化，得到基于T7的mRNA产物。

  Legal Information

  CRISPR正在申请中

  Other Notes

  为了介导DNA位点特异性双链断裂，必须与两条U6-gRNA质粒一起使用。 
  
  文献中使用的标准转染浓度范围为≥1.0 ug/μl且≤5 uL的Cas9-D10A 质粒结合≥1.0 ug/μl且≤5 ul的U6-gRNA质粒。（上述所有浓度均假设是对0.5~1百万个细胞进行核转染）