单细胞全转录组扩增试剂盒 24 次实验步骤

单细胞全转录组扩增试剂盒 24 次实验步骤注意：
1．如果反应体系不是 30 uL，各成分需要等按比例增加或减少。
2．如果 DNA 模板中有 PCR 不明YZ物（植物、土壤和血液等 DNA 样品常含此类 YZ物），可以在 PCR 体系中加入 1/10 的 PCR YZ物清除剂（CAT#：60804， 30uL 体系中加 3uL），可能会对 PCR 有帮助。
PCR 反应的影响因素
单细胞全转录组扩增试剂盒 24 次实验步骤变性温度与时间：
模板变性温度是决定 PCR 反应中双链 DNA 解链的温度，达不到变 性温度就不会产生单链 DNA 模板，PCR 也就不会启动。变性温度低则变性不完全， DNA 双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况 下可设为 94℃ 20~30 秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热 DNA 聚合酶的活力， Z高变性温度不宜超过 95℃。 退火温度与时间：退火温度决定 PCR 特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物 不能与模板牢固结合.
DNA 扩增效率下降；
温度低产量高，但过低可造成引物与模板 错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在 45~68℃之间。设置特定反应的Z 适退火温度，可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引 物的熔解温度 Tm 低 5℃，退火时间一般为 30~60 秒，足以使引物与模板之间完全结 合，长时间退火没有必要。
延伸温度与时间：
PCR 反应的延伸温度一般选择在 70~75℃之间，延伸时间根据所用 聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增 2 Kb 片段，若使用 Taq 酶只需 1 分钟，使用 Pfu 酶则应设定 2 分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现， 时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。
循环次数：
可根据模板 DNA 的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设 定 20-40 个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加， 非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
酶量：
50 μL 反应体系可用 0.5-5 U 酶，酶量的选择与模板 DNA 的量，扩增片段大 小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高 保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能下降。

产品及特点：
易错 PCR（error-prone PCR）是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校对功能的特性，在一定条件下（如不同的 dNTP 浓度、Mg 浓度和 MnCl2存在）能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。易错 PCR 和常规 PCR 的比较如下：本产品就是专门为广大的研究工作者进行易错 PCR 而开发，本产品具有下列特点：
1. 即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化，突变率稳定，突变没有趋向性。易错 PCR 的突变率为 0.66% （±0.13%），详见使用手册疑难解答。
3. 比体内基因突变更快捷简单，但如果在 PCR 引物中设计位点，则可使产物克隆到表达载体，也可以用于体内蛋白活性的筛选。
4. 可用于连续易错 PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5. 只适用于扩增 1kb 以下的产物，对于 1kb 以上的产物，建议分段扩增。 

使用方法：
1. 以 30 uL 的标准 PCR 反应体系为例，如果反应体系不是 30 uL，各成分需要等按比例增加或减少。在一干净的 PCR 管中，加入下列成分：易错 PCR Mix, 10× 3 uL 易错 PCR 专用 dNTP, 10× 3 uL MnCl2, 5 mM 3 uL 自备 DNA 模板（10ng/uL） 1 uL PCR 引物(自备，10 uM each) 10 pmol each Taq DNA 聚合酶（5U/uL） 1 -5 U 补水到 30 uL
2. 按已经优化的 PCR 条件进行一定循环数的 PCR（循环数与突变率的关系见下表），然后取 5 uL 电泳检查。如果没有优化的 PCR 条件，一般可以先尝试下面的 PCR 条件： PCR 前变性 94℃ 3 分钟易错 PCR 94℃ 1 分钟 45℃ 1 分钟 循环 30 次（见注） 72℃ 1 分钟注：易错 PCR 一般不需要热启动，也不需要在 PCR 结束后做延伸处理。
3. 电泳检测是否得到预计长度的 PCR 产物。

细胞名称 种属

CM-H136人牙周膜成纤维细胞完全培养基100mL

人肺间充质干细胞(肺)(HPMSC)(5×105)

小鼠淋巴瘤细胞;P388D1(IL-1) 小鼠胃粘膜上皮细胞完全培养基 100mL

白介素-2转染耐VP16绒癌细胞;JEG-3/VP16-IL-2

JAM2 Others Mouse 小鼠 JAM-2 / JAM-B 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)

小鼠垂体瘤细胞;GT1-1

人表皮血管内皮细胞(HDMEC)( 5×105 )

Raji，人Burkitt's淋巴瘤细胞

人结直肠腺癌细胞;COLO 320DM [COLO320DM] 大鼠肾小管上皮细胞完全培养基 100mL

MLTC-1 小鼠间质细胞瘤细胞

EDA2R Others Human 人 EDA2R / XEDAR / TNFRSF27 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)

CD8B Others Human 人 CD8B / P37 / LEU2 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)

CL-0167NCI-H292(人肺癌细胞)5×106cells/瓶×2

小鼠肠静脉内皮细胞完全培养基 100mL

marc-145猴胚胎肾上皮细胞 Marc-145 monkey embryonic kidney epithelial cells DMEM+10% FBS

LIF Protein Human 重组人 LIF 蛋白 (Fc 标签)

RK1(大鼠肾细胞) 5×106cells/瓶×2 786-0(肾透明细胞腺癌)

CL-0167NCI-H292(人肺癌细胞)5×106cells/瓶×2

CD8B Others Human 人 CD8B / P37 / LEU2 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)

小鼠肠静脉内皮细胞完全培养基 100mL

marc-145猴胚胎肾上皮细胞 Marc-145 monkey embryonic kidney epithelial cells DMEM+10% FBS

LIF Protein Human 重组人 LIF 蛋白 (Fc 标签)

RK1(大鼠肾细胞) 5×106cells/瓶×2 786-0(肾透明细胞腺癌)

四硫磺酸盐煌绿增菌液(TTB肉汤)支*20支用于沙门氏菌选择性增菌培养。

固氮螺菌培养基 250g 用于固氮螺菌平板计数

北沙参亚碲酸钠胨水培养基基础 Beisachang Sodium lurite Broth Base 250 用于金黄色葡萄球菌的增菌培养。每100ml培养基需另加入1%亚碲酸钠0.2ml

血琼脂基础2号250g/瓶用于细菌的培养、分离和鉴别需添加5-维羊血incubationmedia血琼脂基础2号250g/瓶用于细菌的培养、分离和鉴别需添加5-维羊血

MRS琼脂平板(9cm) 10个/包 用于食品中乳酸菌总数测定

盐还原试剂盒5ml*4用于盐还原试验

抗生素5号 Antibiotic NO.5 用于两性霉素B检定菌种培养

布氏琼脂 Brucella Agar 250克 弯曲杆菌的抗生素敏感性试验和纯化培养

V-J琼脂250病源标本和其它标本中甘露醇阳性金黄色葡萄球菌的选择性分离(Merck方法)incubationmediaV-J琼脂250病源标本和其它标本中甘露醇阳性金黄色葡萄球菌的选择性分离(Merck方法)

SIM培养基 250g 用于硫化氢、动力、吲哚试验

葡萄糖铵培养基2300g用于鉴别细菌利用铵盐作为*氮源并分解葡萄糖的试验。

4321-prf UCM-prf 尿道上皮细胞培养基 500 ml incubation media 4321-prf UCM-prf 尿道上皮细胞培养基 500 ml

胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA) 300ml/袋*10 用于药品YJ剂效力检测中细菌检测

叠氮葡萄糖肉汤250g用于链球菌增菌培养

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