6nt 随机引物 ( 抗水解 ),0.5mM100μL实验步骤注意:
1.如果反应体系不是 30 uL,各成分需要等按比例增加或减少。
2.如果 DNA 模板中有 PCR 不明YZ物(植物、土壤和血液等 DNA 样品常含此类 YZ物),可以在 PCR 体系中加入 1/10 的 PCR YZ物清除剂(CAT#:60804, 30uL 体系中加 3uL),可能会对 PCR 有帮助。
PCR 反应的影响因素
6nt 随机引物 ( 抗水解 ),0.5mM100μL实验步骤变性温度与时间:
模板变性温度是决定 PCR 反应中双链 DNA 解链的温度,达不到变 性温度就不会产生单链 DNA 模板,PCR 也就不会启动。变性温度低则变性不完全, DNA 双链会很快复性,因而减少产量。变性温度太高,又会影响酶的活性。一般情况 下可设为 94℃ 20~30 秒,高温时间应尽量缩短,以保持耐热 DNA 聚合酶的活力, Z高变性温度不宜超过 95℃。 退火温度与时间:退火温度决定 PCR 特异性与产量。温度高特异性强,但过高则引物 不能与模板牢固结合.
DNA 扩增效率下降;
温度低产量高,但过低可造成引物与模板 错配,非特异性产物增加。合适的退火温度一般在 45~68℃之间。设置特定反应的Z 适退火温度,可根据引物的(G+C)%含量进行推测,一般实验中退火温度比扩增引 物的熔解温度 Tm 低 5℃,退火时间一般为 30~60 秒,足以使引物与模板之间完全结 合,长时间退火没有必要。
延伸温度与时间:
PCR 反应的延伸温度一般选择在 70~75℃之间,延伸时间根据所用 聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定,如同样扩增 2 Kb 片段,若使用 Taq 酶只需 1 分钟,使用 Pfu 酶则应设定 2 分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现, 时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。
循环次数:
可根据模板 DNA 的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素,设 定 20-40 个循环。循环次数太少,扩增量不足,如果循环次数太多,错配几率会增加, 非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。
酶量:
50 μL 反应体系可用 0.5-5 U 酶,酶量的选择与模板 DNA 的量,扩增片段大 小等有关,酶量过多易发生非特异性反应,而且可能增加突变的机率,尤其在进行高 保真扩增时,应尽量减少酶量,但酶量过少时反应性能下降。
6nt 随机引物 ( 抗水解 ),0.5mM100μL实验步骤产品及特点:
易错 PCR(error-prone PCR)是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的 dNTP 浓度、Mg 浓度和 MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。易错 PCR 和常规 PCR 的比较如下:本产品就是专门为广大的研究工作者进行易错 PCR 而开发,本产品具有下列特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,突变率稳定,突变没有趋向性。易错 PCR 的突变率为 0.66% (±0.13%),详见使用手册疑难解答。
3. 比体内基因突变更快捷简单,但如果在 PCR 引物中设计位点,则可使产物克隆到表达载体,也可以用于体内蛋白活性的筛选。
4. 可用于连续易错 PCR(sequential error-prone PCR),只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5. 只适用于扩增 1kb 以下的产物,对于 1kb 以上的产物,建议分段扩增。
6nt 随机引物 ( 抗水解 ),0.5mM100μL实验步骤介绍:
使用方法:
1. 以 30 uL 的标准 PCR 反应体系为例,如果反应体系不是 30 uL,各成分需要等按比例增加或减少。在一干净的 PCR 管中,加入下列成分:易错 PCR Mix, 10× 3 uL 易错 PCR 专用 dNTP, 10× 3 uL MnCl2, 5 mM 3 uL 自备 DNA 模板(10ng/uL) 1 uL PCR 引物(自备,10 uM each) 10 pmol each Taq DNA 聚合酶(5U/uL) 1 -5 U 补水到 30 uL
2. 按已经优化的 PCR 条件进行一定循环数的 PCR(循环数与突变率的关系见下表),然后取 5 uL 电泳检查。如果没有优化的 PCR 条件,一般可以先尝试下面的 PCR 条件: PCR 前变性 94℃ 3 分钟易错 PCR 94℃ 1 分钟 45℃ 1 分钟 循环 30 次(见注) 72℃ 1 分钟注:易错 PCR 一般不需要热启动,也不需要在 PCR 结束后做延伸处理。
3. 电泳检测是否得到预计长度的 PCR 产物。
人癌细胞;MCF 7B
人囊内壳细胞(HHirSC)( 5×105 )
CL-0447SW 1353(人骨肉瘤细胞)5×106cells/瓶×2
人癌细胞;Hela 229 [HeLa229] 大鼠主动脉平滑肌细胞完全培养基 100mL
P815 小鼠肥大细胞癌细胞
PI3 Others Human 人 Elafin / WFDC14 / Trappin-2 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)
A2780/Taxol? 人卵巢癌紫杉醇耐药株
CL-0139Li-7(人肝癌细胞)5×106cells/瓶×2
11. 前列腺细胞系统
人小细胞肺癌;NCI-H2227 大鼠视网膜色素上皮细胞完全培养基 100mL
大耳山羊皮肤细胞;LDG-3
IL17RA Others Mouse 小鼠 IL17RA / IL17R / CD217 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)
CD3E Others Cynomolgus 食蟹猴 CD3e / CD3 epsilon 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)
CL-0071CT26.WT(小鼠结肠癌细胞)5×106cells/瓶×2
小鼠结肠平滑肌细胞完全培养基 100mL
Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞 Y1 mouse adrenocortical tumor cells RPMI-1640(GIBCO)+10%FBS
LEP Protein Human 重组人 Leptin 蛋白
SF17(人脑瘤细胞) 5×106cells/瓶×2 RT4(膀胱癌细胞)
CL-0071CT26.WT(小鼠结肠癌细胞)5×106cells/瓶×2
CD3E Others Cynomolgus 食蟹猴 CD3e / CD3 epsilon 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)
小鼠结肠平滑肌细胞完全培养基 100mL
Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞 Y1 mouse adrenocortical tumor cells RPMI-1640(GIBCO)+10%FBS
LEP Protein Human 重组人 Leptin 蛋白
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RVSBroth
克氏琼脂 250g 用于铜绿假单胞菌的克氏试验
酵母粉葡萄糖氯霉素琼脂 Yeast Extract Dextrose Chloramphenicol Agar 250 用于食品中霉菌及酵母菌总数测定
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含青霉素酶TSA培养基平板(7cm) 10个/包 用于环境、器皿、设备和表面的无菌检测
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