20126ES50 Nuclear and Cytoplasmic Protein Ext...

产品信息

产品描述

细胞核蛋白、细胞浆蛋白在细胞研究和蛋白质组学中具有重要意义，因此在体外研究中需要将其从细胞或组织中分离。本试剂盒提供了一种较为简单方便，GX的蛋白抽提方法，其原理是：通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。Z后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂C抽提得到细胞核蛋白。

本试剂盒1次可对2×10⁶个细胞和30-50mg组织样品进行抽提，按照该使用量，20126ES50可抽提50个样品，20126ES60可抽提100个样品。

产品组分

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃保存，1年有效。

注意事项

1）客户需自备PMSF。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

将试剂盒各组分溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的试剂A和C备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的Z终浓度为1mM。

1 细胞样品蛋白的抽提

1）细胞处理

对于贴壁细胞：PBS清洗细胞1次，EDTA溶液消化细胞或用细胞刮子刮下细胞，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

【注】：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解抽提的目的蛋白。

对于悬浮细胞：离心收集细胞，PBS清洗细胞1次，收集细胞，尽量吸尽上清，留细胞沉淀备用。

2） 每20μl细胞沉淀加入200μl含PMSF的试剂A。

【注】：对于2×10⁶个Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20μl或40mg。

3） Z高速剧烈涡旋5s，完全悬浮分散细胞沉淀。

【注】：如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长旋涡震荡的时间。

4） 冰浴10-15min。

5） 加入试剂B 10μl。Z高速剧烈涡旋5s，冰浴1min。

6） Z高速剧涡旋5s，4℃12,000-16,000g离心5min。

7） 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，上清即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存备用。

【注】：此步千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免吸到沉淀。

8） 对于沉淀，完全吸尽残余上清，加入50μl含PMSF的试剂C。

【注】：此步需完全吸尽上清，否则会带来细胞浆蛋白的污染。

9） Z高速剧烈涡旋15-30s，把沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2min再高速剧烈涡旋15-30s，共30min。10）4℃ 12,000-16,000g离心10min。

11）立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存备用。

2 组织样品的抽提

1） 将组织切成非常细小的碎片。根据后续使用量按照20:1的比例混合试剂A和B，并加入PMSF至Z终浓度为1mM，混匀即可配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200μl组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。

【注】：匀浆需在冰浴或4℃进行。

2） 匀浆后将匀浆液转移至塑料离心管内，冰浴放置15min。

3） 4℃ 1,500g离心5min。把上清转移至一预冷的塑料管中，上清含部分细胞浆蛋白。

【注】：吸上清时千万不要触及沉淀。

4） 对于上述收集得到的沉淀，已经充分匀浆，但很多细胞仍没有破碎。接下来请参照【细胞样品蛋白抽提】的步骤2）开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，即可得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤【组织样品抽提】中步骤3）抽提得到的细胞浆蛋白合并备用。

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