氯霉素试剂盒

氯霉素（Chloramphenicol）酶联免疫检测试剂盒
使用说明书一、检测原理
本试剂盒是利用竞争ELISA方法，在酶标板微孔上预包被抗 氯霉素抗原。检测时，加入标准品或样品溶液，氯霉素抗体及酶标记物，包被抗原和加入样本中的氯霉素竞争性地与氯霉素抗体结合后，再与酶标记物形成抗原抗体复合物，用TMB底物显色；加入反应终止液，在450nm波长酶标仪下进行检测，样品中的氯霉素浓度与吸收光强度成反比。
二、检测范围
本试剂盒是应用ELISA技术研发的药物残留检测产品,与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出水产组织、畜禽组织、肝脏、蜂蜜及牛奶等中的氯霉素。
三、交叉反应率
与类似物的交叉反应率：
氯霉素 …………………
氯霉素碱…………………<0.1%
甲砜霉素…………………2.1%
氟苯尼考…………………1.5%
四、试剂盒组成
酶标板1块，96孔/板
标准液6瓶（1ml/瓶）：
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
抗体浓缩液 ………………………1ml
酶标记物 …………………………12ml
底物液A …………………………7ml
底物液B …………………………7ml
终止液   …………………………7ml
20X浓缩洗涤液  ………………40 ml
2X浓缩复溶液   ………………50 ml
说明书 ……………………………1份
五、 需要但试剂盒中不提供的器材和试剂
（1）设备
……微孔板酶标仪(450nm)
……振荡器、离心机
……微量移液器：20μl～200μl,100μl~1000μl
……容量瓶：100ml，500ml，1000ml
（2）试剂
……乙酸乙酯、正己烷、
六、溶液的配制
样本前处理需配制：
试剂A：0.36M亚硝基铁溶液(用于牛奶和奶粉处理)
称取11.89g亚硝基铁用去离子水定容至100ml
注明：水溶液分解由红色变成绿色此时不能再用
试剂B：1M硫酸锌溶液（用于牛奶和奶粉处理）
称取16.145g硫酸锌用去离子水定容至100ml
配液1：复溶液1×
2×复溶液在使用前请按1：1稀释
（1份浓缩复溶液+1份去离子水）
配液2：洗涤液
将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水稀释
（1份浓缩洗涤液+19份去离子水;可按需配置）
配液3：抗体工作液
      用配液1将浓缩抗体按1：10体积比进行稀释 （即 
  1ml 浓缩抗体+10ml配液1）
七、样本前处理方法
样本处理前须知
    处理任何样本时，都须注意：
（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
   （2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
样本处理步骤：
(A) 鱼、虾、蟹和组织肉样（样本稀释倍数为1）
（1） 鱼虾蟹、禽肉、畜肉去皮、脂肪，用均质器均质样本，称取3±0.05g均质物于离心管中；
（2）加入3ml去离子水，振荡混匀；
（3）加入6ml乙酸乙酯，振荡5分钟，室温4000转/分，离心10分钟；
（4）移取上层乙酸乙酯2ml到另一离心管中，50℃水浴氮气吹干；
（5） 用1ml正己烷溶解残渣，然后加入1ml复溶工作液振荡1分钟，室温4000转/分，离心5分钟；
（6）去除上层相，取下层水相50μl进行分析。
(B) 蜂蜜样品（样本稀释倍数为1）
（1） 称取2±0.05g蜂蜜于离心管中；
（2） 加入4 ml去离子水，振荡混匀；
（3） 加入4ml乙酸乙酯，振荡混合10分钟，室温4000转/分，离心10分钟；
（4） 移取上层乙酸乙酯1ml到另一离心管中，50℃水浴氮气吹干；
（5） 用1ml正己烷溶解残渣，然后加入0.5ml复溶工作液振荡1分钟，室温4000转/分，离心5分钟；
（6） 去除上层相，取下层水相50μl进行分析。
(C) 牛奶样品（样本稀释倍数为1）
（1） 取10ml牛奶样品于离心管中；
（2） 加入10ml正己烷，振荡5分钟，室温4000转/分，
离心10分钟；
（3） 吸除上层正己烷及中间乳化层。从管底（可避免第5步离心后液体在下层）取5ml去除脂肪的牛奶于另一离心管中；
（4） 加入250μl0.36M亚硝基铁溶液（试剂A），振荡1分钟；
（5） 加入250μl1M硫酸锌溶液（试剂B），振荡5分钟；4℃ 4000转/分，离心10分钟（或在4-8℃冷冻10分钟后再离心）；
（6） 移取2ml上清至另一离心管中，加入4ml乙酸乙酯，
振荡10分钟，室温4000转/分，离心10 分钟；
（7） 移取上层乙酸乙酯2ml到另一离心管中，50℃水浴氮气吹干；
（8） 用1ml正己烷溶解残渣，然后加入900μl复溶工作液振荡1分钟，室温4000转/分，离心5分钟；
（9） 去除上层相，取下层水相50μl用于检测。
八、酶联免疫检测步骤
测定前须知：
1、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在使用中不要让微孔干燥。
4、在ELISA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
5、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用该板膜盖住微孔板。
测定步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，在室温下平衡30分钟，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。
2、加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。室温25℃环境中反应30分钟；
3、小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液 250ml/孔，每次浸泡15~30秒，充分洗涤4－5次，用吸水纸拍干。
4、加酶标记物每孔100μl，用盖板膜盖好，室温25℃下避光反应30分钟。取出酶标板，重复步骤3；
5、每孔先各加入底物液A 50μl，再各加入底物液B 50μl，轻
轻晃荡混匀，并在室温25℃下避光反应15分钟。
6、每孔各加50μl终止液，在酶标仪于450nm处测定OD值（建议用450/630nm双波长检测，在5分钟内读完数据）。
九、结果分析
所测得的标准液或样品吸光度的平均值（B）除以一个标准液（0标准液）的吸光度（B0）值再乘以，得到百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝B/B0 ×
以标准品浓度的10为底的对数为X轴， 百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含氯霉素的量。
利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
十、试剂盒灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：0.05ppb
 样本Z低检测限：
    鱼、虾、蟹、鸡肉和肉样………………0.05ppb
    蜂蜜、牛奶………………………………0.05ppb
回收率：
鱼、虾、蟹、鸡、和肉样…………………100±15%
蜂蜜、牛奶…………………………………90±15%
精密度：
         试剂盒的变异系数均小于10%
十一、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）
会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准
曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应
立即进行下一步操作。
3、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。如不慎滴漏到皮肤上，请尽快用水冲洗。
4、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
5、保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
6、显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。
7、在加入底物液后，一般显色15分钟即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20分钟（或更长），但不得超过30分钟。反之，则减短反应时间。
8、该试剂盒反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
十二、贮藏条件及保存期
贮藏条件：在2～8℃保存试剂盒
保存期：本试剂盒有效期为12个月。