荧光假单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒_详细资料

产品信息

货号： ZY-15-20230 保存条件：负20度供应商：上海泽叶生物科技有限公司保质期：一年英文名： Pseudomonas fluorescens 数量：大量

荧光假单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒
Pseudomonas fluorescens
产品及特点：
荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）是由副黏病毒科麻疹病毒属的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）引起的急性、烈性传染病。它是世界动物卫生组织（OIE）法定的 A 类传染病，我国将其定为Ⅰ类动物疫病。本产品就是以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测荧光假单胞菌的试剂盒。

产品名称 方法规格价格

荧光假单胞菌LAMP试剂盒 LAMP 50次 2490元

荧光假单胞菌PCR试剂盒 PCR 50次 1490元

荧光假单胞菌染料法荧光定量PCR试剂盒染料法 50次 2490元

荧光假单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒探针法 50次 3490元

它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据荧光假单胞菌高度保守区设计，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。

规格及成分

成分编号 十孔盒包装

探针法 qRT-PCR 缓冲液 A 500μL（黄盖）

探针法 qRT-PCR 酶混合液 B 100μL（红盖）

荧光 PCR 专用模板稀释液 C 1 mL（黄盖）

荧光假单胞菌探针法 qRT-PCR引物混合液 D 100 μL（白盖）

荧光假单胞菌 qRT-PCR 探针 E 50 μL（棕色管）

荧光假单胞菌探针法 qRT-PCR阳性对照(1×10E8 拷贝/μL) F 50 μL（黄盖）

核酸释释剂（SY装） G 20 次（1mL，绿盖）

使用手册 H 一份

运输及保存： 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。
自备试剂：样品 RNA。
使用方法
一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液，Z好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
7. 如果有N个样品，Z好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也以选购本公司的柱式病毒RNAout。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂SY装，该释放剂的裂解液可以直接作为RT-PCR模板，省略了RNA提取步骤。
三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR 管，其中N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4 个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）：

成分 样品管N+2个 RT-PCR阴性对照管 标准曲线样品管
（2-7 管）

探针法qPCR缓冲液各 10 μL 10 μL 各 10 μL

探针法 qPCR 酶混合液各 2 μL 2 μL 各 2 μL

荧光假单胞菌qRT-PCR探针各 1 μL 1 μL 各 1 μL

荧光假单胞菌探针qRT-PCR
引物混合液各 2 μL 2 μL 各 2 μL

待测样品 RNA 模板各 5 μL -- --

超纯水 -- 5 μL --

第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号） -- -- 各5 μL（2号样到2号管，3号样到3 号管…）

盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR：

过程温度时间

逆转录 50℃ 30 min

预变性 94℃ 10 min

qRT-PCR 反应（40 个循环） 94℃ 15 sec

60℃ 1 min（采集 FAM 通道的荧光信号）

五、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 35，则为阳性。

温馨提示：不可用于临床ZL。

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荧光 PCR 专用模板稀释液	C	1 mL（黄盖）
荧光假单胞菌探针法 qRT-PCR引物混合液	D	100 μL（白盖）
荧光假单胞菌 qRT-PCR 探针	E	50 μL（棕色管）
荧光假单胞菌探针法 qRT-PCR阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)	F	50 μL（黄盖）
核酸释释剂（SY装）	G	20 次（1mL，绿盖）
使用手册	H	一份

成分	样品管N+2个	RT-PCR阴性对照管	标准曲线样品管（2-7 管）
探针法qPCR缓冲液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探针法 qPCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
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荧光假单胞菌探针qRT-PCR 引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待测样品 RNA 模板	各 5 μL	--	--
超纯水	--	5 μL	--
第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号）	--	--	各5 μL（2号样到2号管，3号样到3 号管…）

过程	温度	时间
逆转录	50℃	30 min
预变性	94℃	10 min
qRT-PCR 反应（40 个循环）	94℃	15 sec
qRT-PCR 反应（40 个循环）	60℃	1 min（采集 FAM 通道的荧光信号）