荧光假单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒

通用原则：
1， 荧光假单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。
2， 扩增子的长度应不超过400bp，理想的Z好能在100－150bp内，扩增片断约短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性
3， 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号。
4， 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）
5， 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
b），探针设计指导
1，在设计引物之前设计探针
2，探针的Tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区。
3，探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在
4，选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
6， 探针应尽可能的短，不要超过30个bp。
7， 检测探针的DNA折叠和二级结构。

产品名称	荧光假单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒
英文名称	Pseudomonas fluorescens
编号	FS01P1801

产品特点：
1. 使用化学修饰的热启动聚合酶，反应特异性高，*程度地避免了非特异扩增；
2. 反应缓冲液经充分优化，反应灵敏快速，40个循环只需20多分钟；
3. 抗干扰能力强，反应重复性高，适合对土壤、粪便、肿瘤和血液来源的复杂样本中的靶基因进行检测分析。
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，Z后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
 特异性荧光标记：
 TaqMan法
 TaqMan探针的特性：
（1）5′端标记有报告基团（Reporter, R），如FAM、VIC等
（2）3′端标记有荧光淬灭基团 （Quencher, Q）
（3）探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光
（4）Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
相对定量通过内标定量：
内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因，在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小，内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量。
相对定量分析方法  ：
 2-ΔΔCt
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内
  1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：
    ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test） 
    ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator） 
  2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
         ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
  3、计算表达水平比率：
                    2 –ΔΔCT=表达量的比值

内标对荧光定量PCR的影响：
1．实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
　　1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
　　2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
2．内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图：

乙酰CoA羧化酶  acetyl CoA carbosylase  3.125  100  U/ml  0.1
脂肪合成酶  Fatty acid synthase  37.5  1200  U/ml  1
甘油-3-酰转移酶  glycerol-3-phosphate O-acyltransferase  12.5  400  U/L  1
脂肪酶  Lipase  10  320  U/L  1
肉毒棕榈酰转移酶  carnitine palmitoyltransterase  15  480  U/L  1
脂肪转运蛋白  fatty acid transport protein  0.625  20  ng/ml  0.1
脂肪脱饱和酶  fatty acid desaturase  3.75  120  U/L  0.1
葡萄糖激酶  Glucokinase  2.5  80  U/L  0.1
胰岛素  Insulin  1.5  48  mIU/L  0.1
酰辅酶A化酶  Acyl-CoA Oxidase  20  640  U/L  1
甲酰合成酶1  carbamoyl phosphate synthase 1  25  800  pg/mL  1
甲酰合成酶1  carbamoyl phosphate synthase 1  7.5  240  mU/mL  1
羟化酶  phenylalanine hydroxylase   3.125  100  U/L  0.1
甘油-3-酰转移酶  glycerol-3-phosphate O-acyltransferase  12.5  400  U/L  1
脂肪转运蛋白  fatty acid transport protein  0.625  20  ng/ml  0.1
脂肪脱饱和酶  fatty acid desaturase  3.75  120  U/L  0.1
葡萄糖激酶  Glucokinase  2.5  80  U/L  0.1
荧光假单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒诺氟沙星杂质E75001-78-4中检所20mg/支，HPLC检查
α-对羟甘 α-p-hydroxyphenylglycine中检所30mg，供有关物质测定用
二十五(顺-5，8，11，14，17)/EPA(C20:5)104174-4美国二十五(顺-5，8，11，14，17)/EPA(C20:5),标准品，有证书 ,50mg/100mg/500mg/1gm
素丁三100mg
细菌内灭活验证标准品中检所10000EU/支，供验证干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备去除细菌内的有效性用
盐溴索杂质B 反式-4-(6,8-二溴-四啉环己）盐盐15942-08-2中检所20mg/支，供HPLC限度检查用
乌头双酯型生物对照提取物中检所约30mg/支，供含量测定用
玉米（地）0克美国玉米（地）0克,标准品，有证书 ,10g
盐奥普力农 Olprinone Hydrochloride中检所100mg/支，供含量测定用
天仙藤3g
醋反亚油酯/十八二(反,12)/反亚油(C18:2TT)美国醋反亚油酯/十八二(反,12)/反亚油(C18:2TT),标准品，有证书 ,100mg/500mg/1gm
二十二四酰(顺-7,10,13,16)/花生四酰(C22:4)美国二十二四酰(顺-7,10,13,16)/花生四酰(C22:4),标准品，有证书 ,100mg
荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：
(1)将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线；
(2)待测样本与步骤(1)所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。
其中步骤(1)为：将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线。
其中所述参照基因为本领域常规参照基因，较佳地管家基因，优选地为RPPH1的扩增区域，其中所述质粒载体为本领域常规质粒载体，较佳地为PCR克隆载体，优选地为TA cloning载体，所述TA cloning载体较佳地为pMD18-T载体。其中所述标准品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例较佳地为1：1。由于标准品中待测目的基因与参照基因的比例为1:1，解决了目前相对标准曲线法应用中目的基因与参照基因的浓度比例关系难以控制的问题，提高HER2基因扩增检测的可靠性。
步骤(2)为：待测样本与步(1)所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。
其中所述待测目的基因为本领域常规待测目的基因，较佳地为肿瘤或者疾病的特异性基因，更佳地为HER2基因的扩增区域，所述荧光定量PCR扩增为本领域常规荧光定量PCR扩增方法，所述荧光定量PCR扩增方法较佳地为多通道荧光定量PCR扩增，更佳地为双通道荧光定量PCR扩增。