CRISPR/Cas9基因敲除技术服务

本技术服务提供基于CRISPR/Cas9技术的目的基因敲除用慢病毒或目的基因敲除的指定细胞株，并且无论是慢病毒和细胞株都经过金标准T7E1法的验证。特别是目的基因敲除的多克隆细胞株，仅需30天即可获得并可用于目的基因敲除后的功能检测。

• 碧云天CRISPR/Cas9基因敲除技术服务项目表：

• 碧云天CRISPR/Cas9技术服务优势：

1. 技术新：基于的CRISPR/Cas9技术，有效敲除目的基因并避免脱靶效应。
2. 标准严：可以提供经过金标准T7E1法验证的慢病毒或细胞株，也可以提供经过Western blot验证的多克隆细胞株。
3. 筛选快：碧云天自行研发了基于CRISPR/Cas9技术的sgRNA快速筛选和验证体系，确保了可以在Z短的时间内完成sgRNA的筛选和T7E1法验证，同时也降低了筛选成本。
4. 时间短：目的基因敲除的多克隆细胞株仅需30天即可完成；单克隆细胞株一般在60天完成。
5. 价格低：CRISPR/Cas9基因敲除多克隆细胞株低至11111元，基因敲除用慢病毒低至8888元。

• 碧云天CRISPR/Cas9技术服务选购建议：

1. 对于CRIPR/Cas9技术不是很熟悉的用户，我们优先推荐选择T0411或T0413直接获取目的基因敲除的多克隆细胞株，这样就直接可以开始目的基因敲除后的功能研究了。希望在多个细胞株中研究目的基因敲除后的功能时，我们优先推荐选择T0411和T0428或T0413和T0431。T0413和T0431增加了Western blot验证，敲除效果更有保障。
2. 对于CRISPR/Cas9技术比较熟悉，能自行进行多克隆或单克隆细胞株的筛选并能自行进行T7E1鉴定的，在经费许可的情况下我们优先推荐选择T0408，仅当经费比较紧张的情况下可以考虑选择T0405。需要注意的是，T0405尽管经过我们的筛选，很可能后续T7E1验证会取得成功，但我们无法保证后续T7E1验证一定成功。希望在多个细胞株中研究目的基因敲除后的功能时，在经费许可的情况下我们优先推荐选择T0411和T0428，或T0413和T0431，仅当经费比较紧张的情况下可以考虑选择T0408或者T0405。对于T0408和T0405，我们推荐选择经过T7E1验证的T0408。仅当需要对大量基因进行基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除时，可以考虑选择T0405，此时可以节省一些费用并总是会检测到大部分基因被顺利敲除的。
3. 对于经费充足的情况下可以考虑选择T0418，直接获得经过测序验证的单克隆双等位基因敲除细胞株，省心省力。

• 碧云天CRISPR/Cas9技术服务流程：

1. 用户下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书，发送至service@beyotime.com。
2. 双方确认并签订技术服务协议书，按照协议内容进行技术服务。

• 碧云天CRISPR/Cas9技术服务示例：

基于CRISPR/Cas9技术的X基因敲除细胞株的构建

1. 根据用户提供的目的基因名称和基因ID，查找基因序列。
2. 设计3-5条sgRNA序列。构建含puromycin抗性的sgRNA和Cas9表达质粒。

1. sgRNA切割靶基因DNA活性检测：

图2. sgRNA切割靶基因DNA活性检测和筛选。图中显示sgRNA1和sgRNA3有较强的切割活性，而sgRNA2的切割活性很弱。

1. 选择对靶基因DNA切割活性强的sgRNA和Cas9表达质粒，包装慢病毒并测定滴度。同时包装靶向GFP或无任何靶向的对照慢病毒并测定滴度。
2. 慢病毒感染目标细胞株，并用puromycin进行筛选。
3. 筛选获得的细胞株进行T7E1验证。

图3. 基因敲除细胞的T7E1法验证。敲除位点上下游设计PCR引物，提取细胞基因组DNA后进行PCR扩增。对PCR产物进行变性和退火处理后加入T7E1 (核酸内切酶，只切割碱基错配的DNA)，敲除(knockout, KO)细胞的PCR扩增产物经T7E1消化后可见明显的切割条带，说明预期的敲除位点附近存在大量sgRNA引导Cas9切割形成的缺失突变。

1. 目的基因敲除的Western检测验证(由于涉及是否存在合适抗体用于检测的问题，本项内容不包含在常规的技术服务范围内，如果需要须另行协商)。

图4. 目的基因敲除的Western验证。筛选获得的阳性细胞传代2次后，取细胞制备蛋白样品，每孔的蛋白上样量为20μg。用抗目的蛋白X的抗体进行检测，检测Actin作为内参。标示sgGFP的为感染了靶向GFP的慢病毒后筛选获得的细胞，标示sgX的为感染了靶向目的基因X的慢病毒后筛选获得的细胞。

1. 目的基因敲除细胞的功能分析参考图5和6(本项内容不包含在常规的技术服务范围内)。

图5. 在诱导细胞死亡的条件下，只有敲除基因X的细胞可以存活。原始细胞(naive)及阴性对照细胞(sgGFP)约80%死亡。

图6. X基因敲除影响蛋白M的磷酸化。X基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中蛋白M被特定处理诱导的磷酸化被完全YZ(A)。在通过CRISPR/Cas9技术X基因敲除的细胞中进行相同的实验，实验结果与MEF结果一致(B)。