概述
我们的pUASTB载体系统是一个GX的转基因果蝇制备和基因表达控制系统。该系统能够利用果蝇P元件转座子系统(如pUAST)或噬菌体φC31整合系统(如pUASTattB)并结合强诱导型启动子Gal4调节转基因的表达。因此,pUASTB载体系统可用于P转座子和φC31整合酶介导目的基因插入。目的基因会被克隆到pUASTB两个P-元件末端重复序列中间和attB重组位点附近的区域。
为了实现P转座子介导的插入,将pUASTB质粒和表达P转座酶的辅助质粒共同导入宿主细胞或胚胎中。 接着,由辅助质粒产生的转座酶识别pUASTB质粒上的两个P元件末端重复序列,并将包含两个P元件末端重复之间的序列插入宿主基因组中。
为了实现φC31整合酶介导的插入,将pUASTB质粒和表达φC31整合酶的辅助质粒共同导入宿主细胞或含有attP位点的胚胎中。φC31整合酶介导attB和attP位点之间的不可逆重组,导致pUASTB载体线性化并整合到宿主基因组中。
mini white基因的表达,可以使果蝇的眼色发生变化,是鉴定转基因果蝇成功与否的标记。
在pUASTB系统中,目的基因将被克隆到合成诱导型启动子的下游,该启动子由5个串联排列的GAL4结合位点(5xUAS)和hsp70 TATA box组成。目的基因依赖于GAL4的表达,GAL4蛋白在与pUAST质粒上的UAS位点结合后会激活目的基因的转录。因此,在没有GAL4表达的情况下,目的基因保持沉默,但是通过与表达GAL4的果蝇系杂交后,在GAL4表达的细胞中,目的基因会被转录激活。
亮点我们的pUAST果蝇基因表达载体可有效实现P转座酶或φC31整合酶介导的基因插入或目的基因GAL4依赖性表达。我们的载体在大肠杆菌中具有高拷贝,可用于GX产生转基因果蝇。
优势
特定位点插入:基于φC31的插入具有位点特异性,通常仅发生在attP位点,降低了破坏内源基因或插入位点不当影响转基因表达的风险。
高水平表达:5×UAS/mini_Hsp70启动子可以在诱导状态下使目的基因高水平表达。
选择性表达: 不存在GAL4的情况下,目的基因的转录水平很低或没有;在GAL4的存在下,则能实现高水平的基因转录。
GX:使用φC31整合酶实现种系转基因比基于P元件的载体系统如pUAST更有效。