CRISPR/Cas9定点插入细胞系的构建

根据给定GeneID或DNA序列，需要插入的DNA序列，以及插入位置。在插入位置位置附近设计3个sgRNA，构建载体质粒。根据插入DNA的序列以及插入位置两侧的DNA序列，构建包含插入序列以及两侧左右同源的Donor载体。验证待基因插入细胞的单克隆生长能力、药杀浓度、转染条件、载体效率。 完成以上工作后，将效率的载体与Donor载体共转染待基因插入的细胞。转染后进行药杀，之后通过有限稀释进行单克隆的分选。通过测序验证是否得到插入的细胞系。

Cas9系统使目标区域的基因组断裂，利用基因组自身的修复机制，将外源基因（两端包含同源臂）通过同源末端重组的方式插入到基因组中，获得稳定遗传的一种技术。

2.1 通过将基因敲入的个体或细胞与正常的个体或细胞相比较，研究者可以揭示特定基因的功能。
2.2 在基因组水平上将目标基因修改或变成无效等位基因，遗传背景干净清晰，是研究基因功能的金标准。

3.1 CRISPR/Cas9技术优势
（1）在基因组水平上编辑目标基因，高度模拟目标模型。
（2）遗传背景干净清晰，多次重复实验结果更稳定。
（3）技术热点高增加文章的影响力。
3.2 RNAi技术的缺点
（1）仅部分YZ该基因的功能。
（2）在转录后（包括翻译）水平上下调基因表达，非基因组水平上的彻底改变！
（3）会出现每次实验间的误差。
（4）非特异性强；脱靶效率高（Smith et al., 2017. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol 15(11): e2003213. )

1.特有的检测手段可大大缩短服务周期
2.可同时进行支原体检测以及目标细胞株的STR鉴定
3.若实验未按预期完成，技术费用全免！
4.相邻的10bp内多位点的突变与单一点突变价格相同

 客户只需提供GeneID——基因分析以及细胞状态评估———构建载体——细胞转染——单克隆筛选——目标基因插入的细胞株的获得