北京现货Histone Deacetylase1/HDAC1 mRNA原位杂交试剂盒优惠

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名称：北京现货Histone Deacetylase1/HDAC1 mRNA原位杂交试剂盒优惠
编号：ZN0656
规格：100T
品Pai：百奥莱博
产地：北京
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human,rat,mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液2ml；
3.Histone Deacetylase1/HDAC1 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液2ml；
4.封闭液5ml；
5.生物素化鼠抗Digoxin5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：Z重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以YZRNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗Digoxin：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
Histone的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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SV1180 Lambda DNA
YT121 细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒(柱式吸附) DNA Ladder Extraction Kit with Spin Column
BTN120615 dATP溶液(100mM) dATP Solution(100mM)
SY0446 红色荧光标记人源低密度脂蛋白 Human DiI-LDL
SV0337 EcoNI限制性内切酶 EcoNI Restriction Endonuclease
WE0113 BaHF高保真DNA聚合酶 BaHF High Fidelity DNA Polymerase
HR0348 洗涤液(Western) Western cleaning solution
SY0084 GAS-Luc荧光素酶报告基因质粒 GAS luciferase reporter plasmid
BTN131226 Karnovsky固定液 Karvovsky Fixative Solution
KFS059 SDS-PAGE电泳液(干粉)
SV1633 SNAP-Surface 488
YT374 DNA聚合酶(高保真)(GX率)(双平端克隆) Efficient & HiFi DNA Polymerase
BTN111116B 一站式GST标记蛋白质微量纯化套装(含溶菌酶和核酸酶) One-Stop GST-Tagged Protein Miniprep Pack(B)
HR0055 植物蛋白提取试剂盒 Plant protein extraction kit
SV0980 5-甲基-dCTP
YT021 DNA Ladder(100bp-10kb)(21条带)(DNA分子量标准) DNA Ladder (0.1-10 kb, 21 bands)
BTN70503X DNA marker(100-1500bp) DNA ladder(100-1500bp)
SY0332 斑蝥素(蛋白*(代"磷")酸酶2AYZ剂) Cantharidin (Inhibitor of PP2A)
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·ECM Kit(大鼠IgG)
编号：ZN1927
规格：1盒
用途：适于一抗为大鼠IgG的Western Blotting检测。
保存条件：4℃可保存一年。
Western Blotting检测试剂盒内容：
1.封闭试剂：10g蛋白质干粉(脱脂奶粉)。
2.HRP标记兔抗大鼠IgG：0.1ml亲和纯化抗体，经过人血清吸附以去除交叉抗体。效价1：2000-10000。
3.ECM显色剂：总量100ml。含A液5ml(×20倍)；B液5ml(×20倍)。每个试剂盒足够10张小膜或800 c㎡面积的膜显色
工作原理：
蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。根据所采用的支持物不同,可分为：琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙*(代"烯")酰胺凝胶电泳等。其中以聚丙*(代"烯")酰胺凝胶电泳(PAGE)Z广泛。它的优点为：无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶。SDS-PAGE是Z常用的定性分析蛋白质的电泳方式,它根据蛋白分子大小不同，迁移速率的不同而达到分离目的，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
免疫印迹是将凝胶电泳的高分辨力和免疫化学检测的特异性融为一体。免疫印迹技术首先借助凝胶电泳将蛋白质抗原分离，然后将凝胶中的蛋白质转印到膜上使之成为被分离的一个拷贝。免疫印迹为检测样品中是否存在目的蛋白提供一种可靠的方法，该法鉴定蛋白质的原理是根据被测蛋白能与特异性抗体结合的特性并通过相对迁移率来体现该蛋白的分子量。如果想要了解样品中是否存在某一抗原，以及该抗原的含量或该抗原多肽链的相对分子质量以及亚型，是否与其他蛋白结合，蛋白质的酪*酸残基是否发生磷酸化等有关问题均可采用免疫印迹。
免疫印迹包括多个简单步骤，可在一到两天完成，该方法具有GX，简便，灵敏等特点。
实验操作步骤：
1．蛋白质的样品制备：
1)细胞培养蛋白质样品的制备：
1：胰酶消化后裂解：细胞培养至80%左右密度时，以含0.25%胰蛋白酶消化,室温，低速离心，弃上清。细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入0.1-1ml裂解液(根据细胞数量定)反复吹打。
2：皿上直接裂解：细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入0.1-1ml裂解液(根据细胞数量定)，用细胞刮刀收集，转移至离心管中，反复吹打。
2)组织样品的制备：新鲜组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，按组织净重：裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清(如有粘稠物可超声处理)
3)蛋白变性：处理后的样品加入样品缓冲液(按样品浓度1：1或1：2的比例)混匀，样品置1000C的水浴箱加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液。(样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃可稳定保持数月。)
2．SDS-PAGE电泳：
1)．制胶：①按比例配制分离胶(丙*(代"烯")酰胺母液：单体：双体=29：1)，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，37℃恒温箱中静置60min。
②同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多的氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，37℃恒温箱中静置60min以上以保证完全聚合。
2)加样：依次加入标准品和待分析样品。(加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。样品一般在1.0mm厚的胶加样50-100ug/lane)。
3)电泳：加样完毕，选择适当的电压进行电泳即可。一般采用恒压浓缩胶55V，分离胶75V，电泳直至*酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。
3．转膜：蛋白质经SDS-PAGE分离后，从凝胶中转移到固相支持物上，常用的支持物有：硝酸纤维膜即NC膜(AR0135)或PVDF膜。Tris/甘*酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘*酸缓冲液中漂洗数秒。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，包括湿式电转印和干式电转印。
1)干式电转印：将转印槽阴极平放工作台上，并在上面加三张电转印液浸透的1mm厚的滤纸，将电转印液浸透0.45μm的N.C膜放在滤纸上，再将凝胶平放在N.C膜上，在凝胶上加盖三层电转印液浸透1mm厚的滤纸，电流根据凝胶面积按1-2 mA/cm2,接通电源，经1-1.5小时电转印。
2)湿式电转印：打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放三块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜、凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，将NC膜平放在凝胶上，按照(-)夹板-海棉-滤纸-胶块-NC膜-滤纸-海绵-夹板(+)装好,依次除尽每层间气泡，夹好电转印夹。电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极,4℃ 250-300mA,转印80min(根据
分子量不同，转印时间可适当调整)。
4、膜的封闭：漂洗转印膜,室温，3次x10min,以尽量洗去转印膜上的SDS(以免影响抗体的结合)，放入0.02M TBS缓冲液配置的5%脱脂奶粉和1%的BSA混合的封闭液内，摇床摇动，室温封闭2h或4℃过夜。1×TBS-T ，PH7.6洗
液，室温漂洗10min。
5、抗体杂交：1)封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入用0.02M TBS缓冲液配置的2%脱脂奶粉和1%的BSA混合的稀释液适当稀释的适当稀释的一抗，4℃孵育过夜或37℃孵育2h，1×TBS-T ，PH7.6洗液洗膜3次x10min。(一抗的稀释度，孵育时间，温度与显色强度，背景有直接关系。一般来说，阳性不强时可提高一抗浓度和延长孵育时间，而背景高，非特异性条带多，则降低抗体浓度和孵育时间)。
2)用0.02M TBS缓冲液配置的2%脱脂奶粉和1%的BSA混合的稀释液适当稀释过氧化物酶标记兔抗大鼠IgG孵育膜，20℃-37℃,1.5小时或4℃过夜，1×TBS-T洗膜3×10min。
6、显色(ECM)
ECM显色剂配制:按1ml蒸馏水，加显色剂A、B各1滴混匀。将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的显色液反应约1-5分钟。吸去印迹膜边缘显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,以确保×感光胶片的干燥。印迹膜转入暗室中使胶片曝光30＇-5分钟。
7、显影，定影。
将曝光后的×感光胶片放入显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止,再放入定影液中定影，胶片可长期保存。


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·丽春红染色液(1×)
编号：ZN1901
规格：100ml
产品保存：4℃保存，一年有效。
产品说明：
印迹膜丽春红染色液可以用于PVDF膜、硝酸纤维素膜(NC膜)上的蛋白的检测。染料带负电荷，可以与带正电荷的*基酸残基结合，同时染料也可以与蛋白的非极区相结合，从而形成红色的条带。染料对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS或其它适当溶液洗去。本试剂使用方便，本底低，灵敏度较高，对蛋白的检测下限是250ng。
使用方法：
1.将膜浸没在染色工作液中，摇床震荡3-5分钟或更长时间，直至出现清晰条带,对结果作适当记录。
2.用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除染料，可进行后续的免疫印迹检测。
注意事项：丽春红染色液不适用于尼龙膜上的蛋白的检测。

·SHH mRNA原位杂交试剂盒
编号：ZN1271
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human,rat,mouse,chicken
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液2ml；
3.SHH mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液2ml；
4.封闭液5ml；
5.生物素化鼠抗Digoxin5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：Z重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以YZRNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗Digoxin：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
SHH的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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