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北京百奥莱博专业生产供应4×Tris-HCl分离胶缓冲液,pH8.8北京厂家,我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂,价格优惠,欢迎广大科研工作者垂询订购。
名称:4×Tris-HCl分离胶缓冲液,pH8.8北京厂家
编号:SY0355
规格:250ml
英文名:4×Tris-HCl Separating Gel Buffer, pH8.8
品Pai:百奥莱博
产地:北京
4×Tris-HCl分离胶缓冲液中含有1.5M Tris base,用HCl调节pH8.8,25 ℃。可用于SDS-PAGE或native PAGE下层胶的配制,本产品不含SDS,如配制SDS-PAGE,需另外添加10%SDS(SY0352),或购买4×Tris-HCl-SDS分离胶缓冲液(SY0354)。
Tris英文名称:Tris base;2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol
分子式:C4H11NO3
分子量:121.14。
储存条件:室温。
除4×Tris-HCl分离胶缓冲液,pH8.8北京厂家外,我公司正在打折促销以下产品:
·His标签蛋白琼脂糖纯化树脂
编号:SY0392
英文名称:Ni-NTA Agarose Resin
规格:10ml
Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体,螯合镍离子(Ni2+)后,形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的ZX,这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻,与Ni-IDA树脂相比,更加稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可获取的树脂之一。
基质(Matrix):高度交联的4%琼脂糖凝胶
孔径(Bead size):45-165µm
载量(Capacity):>40mg 6×His-tagged protein/ml 基质
耐压(Tolerance Pressuremax):0.1MPa, 1bar
储存缓冲液:含20%乙醇的1×PBS
储存条件:4℃,有效期2年。
使用方法
(一)纯化流程
1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。Buffer 在使用前Z好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤CJ。可溶性组*酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组*酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。
2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达的蛋白纯化为例)
1)挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中,根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2)表达结束后,将培养液转至离心瓶,7000rpm,离心15min,收集菌体,然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSF(PMSF在破碎前加入,其终浓度为1mM),同时也可加入其他蛋白酶YZ剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3)之后加入溶菌酶,使其工作浓度为1mg/ml。【注】:如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE,可以不加入溶菌酶。
4)将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I),混匀,置于冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。
5)收集上述澄清蛋白液,10000rpm,4℃离心20-30min。取上清0.22µm或0.45µm滤膜过滤后置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶,5000rpm离心10min,收集上清。如上清中不含EDTA、组*酸和还原剂等,即可直接上柱纯化;如含有EDTA、组*酸和还原剂等物质,则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】:对于大量体积的上清,需加入硫*(代"酸")铵进行沉淀浓缩,之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)
1)将培养液转移至离心瓶,7000rpm,离心15min,收集菌体去上清。
2)按照菌体:裂解液=1:10(w/v)的比例将菌体充分悬浮,混匀,冰浴超声破碎。
3)将破碎液转移至离心管,10000rpm,4℃离心20-30min,去上清。可重复步骤2)和3)一次。
4)按照菌体:裂解液(含8M尿素)=1:10(w/v)的比例将包涵体充分悬浮。
5)变性条件下纯化His标签蛋白纯化。
3样品纯化
1)装柱:将Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化柱中。
2)清洗:3-5倍柱体积去离子水冲洗色谱柱。
3)平衡:至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。
4)上样:注意控制加样速度,确保目的蛋白与Ni2+充分接触,以提高纯化得率。
【注】:注意收集流出液,用于后续SDS-PAGE检测蛋白的结合情况。
5)平衡/洗杂:Wash Buffer 平衡柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。注意收集流出液。
【注】:在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6)洗脱:使用5-10倍柱体积Elution Buffer洗脱,收集洗脱液即目的蛋白溶液。
7)清洗:依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。
【注】:建议在清洗之前用更高浓度咪唑(如500mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。
8)保存:5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂,将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中,置于4℃保存。
4 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。
(二)在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高(>0.5Mpa)或者填料上面出现明显的污染时,需对其进行在位清洗(Cleaning-in-Place,CIP)。在位清洗时,先把Ni2+脱掉,清洗结束后,将填料保存在20%乙醇中,后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
1 去除强疏水结合的蛋白,脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积,接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液,接触时间为1-2h。去污剂处理后,需用70%的乙醇清洗5倍柱体积,彻底去除去污剂。利用去离子水清洗10倍柱体积。
2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min,之后用去离子水清洗10倍柱体积。
(三)填料再生
当填料使用过程中发现反压过高,填料上面出现明显的污染,或填料载量明显变低时,需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理,即填料再生。按照下面操作流程进行:
1)使用0.2M 醋酸溶液(含6M GuHCl)清洗2倍柱体积;
2)去离子水清洗5倍柱体积;
3)2%SDS清洗3倍柱体积;
4)去离子水清洗5倍柱体积;
5)乙醇清洗5倍柱体积;
6)去离子水清洗5倍柱体积;
7)100mM EDTA(pH 8.0)清洗5倍柱体积;
8)去离子水清洗5倍柱体积;
9)100mM NiSO4清洗5倍柱体积;
10)去离子水清洗10倍柱体积。
填料再生后,可立即使用,也可保存在20%乙醇中,置于4℃备用。
附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
缓冲液名称 | 配方 | 配制1L溶液所需各种试剂量 |
Lysis Buffer (pH8.0) | 50mM NaH2PO4 300mM NaCl 10 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ | NaH2PO4 ·2H2O 7.8g NaCl 17.54g Imidazole 0.68g |
Wash Buffer (pH8.0) | 50mM NaH2PO4 300mM NaCl 20 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ | NaH2PO4 ·2H2O 7.8g NaCl 17.54g Imidazole 1.36g |
Elution Buffer(pH8.0) | 50mM NaH2PO4 300mM NaCl 250 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ | NaH2PO4 ·2H2O 7.8g NaCl 17.54g Imidazole 17.0g |
附表2 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
缓冲液名称 | 配方 | 配制1L溶液所需各种试剂量 |
Lysis Buffer (pH8.0) | 8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐*(代"酸")溶液调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ | Urea 480.5g NaH2PO4 ·2H2O 15.6g Tris 15.76g |
Wash Buffer (pH6.3) | 8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐*(代"酸")溶液调pH至6.3, 0.22µm或0.45µm过滤CJ | Urea 480.5g NaH2PO4 ·2H2O 15.6g Tris 15.76g |
Elution Buffer(pH4.50) | 8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐*(代"酸")溶液调pH至4.5, 0.22µm或0.45µm过滤CJ | Urea 480.5g NaH2PO4 ·2H2O 15.6g Tris 15.76g |
附表3 Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况
试剂种类 | 浓度 |
还原剂 | 5mM DTE 0.5-1 mM DTT 20mM β-mercaptoethanol 5mM TCEP 10mM reduced glutathione |
变性剂 | 8M urea 6M Gua-HCl |
去污剂 | 2% TritonTM X-100(nonionic) 2% TweenTM20(nonionic) 2% NP-40(nonionic) 2% Cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic) |
其他类 | 500mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100mM Na2SO4 1.5M NaCl 1mM EDTA 60mM citrate |
缓冲液 | 50mM sodiu*(代"m") phosphate, pH7.4 100mM Tris-HCl, pH7.4 100mM Tris-acetate, pH7.4 100mM HEPES, pH7.4 100mM MOPS, pH7.4 100mM sodiu*(代"m") acetate, pH7.4 |
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SV0829 BalbBuffer 3.1 (10X)
WE0289 SDS-PAGE上样缓冲液(非还原,5×) SDS-PAGE Loading Buffer(non-Reducing,5×)
BTN81107 无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒 Endotoxin-free plasmid DNA large-scale extraction kit
SV1306 pBR322 DNA-Msp I 消化
RFT105 Oligo(dT)18 Primer
KFS234 TRADD蛋白检测试剂盒 TRADD Detection Assay(Western Blot)
SY0474 细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-Alexa Fluor 488/PI) Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit
YT607 谷胱甘肽合成酶2 Glutathione Synthase 2 (Crude Enzyme)
BTN131013 ATP溶液,1mM ATP adenosine triphosphate Solution,1 mM
HR0388 蛋白浓缩柱 Protein concentration column
SY0112 STAT5-Luc荧光素酶报告基因质粒 STAT5 luciferase reporter plasmid
YT197 AP1凝胶迁移突变探针(10μM) AP1 Mutation Probe For EMSA(10μM)
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·脱氧胞苷三磷酸溶液(100 mM)(dCTP)
编号:SY0042
英文名称:dCTP Solution(100 mM)
规格:400ul
dCTP即2-deoxycytidine 5-triphosphate,中文名为脱氧胞苷三磷酸,常用于PCR、real-time PCR、RT-PCR、cDNA合成、引物延伸反应、DNA测序、DNA标记等各种常规分子生物学反应。
本产品为溶液*盐形式,用超纯水配制,并用高纯度NaOH溶液调节pH值至7.0,浓度为100mM。
经检测,dCTP纯度大于99%(HPLC),且无DNase和RNase污染。本产品为即用型,可以直接用于PCR等各种常规分子生物学反应。
注意事项
1)可以室温溶解,溶解后宜存放于冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即置于-20℃保存。
2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
储存条件:-20℃,避免反复冻融。
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温馨提示:不可用于临床ZL。