北京实时荧光定量PCR的预混体系(探针法)(高含量ROX校正染料)说明书

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、YL及其他非科研用途。

北京百奥莱博主要从事生物试剂的生产和销*(代"售")，产品线涵盖北京实时荧光定量PCR的预混体系(探针法)(高含量ROX校正染料)说明书在内的分子生物学试剂产品，还包括PCR及荧光定量PCR、核酸提取试剂盒类、样本核酸保护试剂、核酸提取、克隆与转化、蛋白纯化、蛋白检测、免疫组化、细胞凋亡与抗体等。

名称：北京实时荧光定量PCR的预混体系(探针法)(高含量ROX校正染料)说明书
英*(代"文")名：BaldStar TaqMan Mixture(High ROX)
编号：WE0146
产地：国产|进口
品Pai：百奥莱博
规格：5ml
  本品是专用于探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×，包含BaldStar Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs和Mg2+，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列检测，如基因表达分析，拷贝数分析，SNP基因型分析等，适用于不同类型探针法荧光定量。本品含有的BaldStar Taq DNA Polymerase是一种经化学修饰的、全新GX热启动酶，在常温下没有聚合酶活性，有效避免了在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活须在95℃下孵育10分钟。独特的PCR缓冲体系与热启动酶的组合，显著提高了PCR的扩增效率，荧光信号更强，灵敏度更高，可以检测单拷贝的模板。使用本产品可以得到更广的线性范围，对目的基因定量更准确。适用于无需ROX作为校正染料的所有荧光定量PCR仪。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器(WE0144)：
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器(WE0145)：
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器(WE0146)：
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

产品组成：

 

组份	WE0144-5ml	WE0145-5ml	WE0146-5ml
2×BaldStar TaqMan Mixture	5×1ml	5×1ml	5×1ml
50×Low ROX	-	200μl	-
50×High ROX	-	-	200μl
ddH2O	5×1ml	5×1ml	5×1ml

注意事项：
1．使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2．避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。

使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系：
 

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×BaldStar Taq Man Mixture	25μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Probe，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
50×Low ROX or High ROX(可选)	1μl	1×
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50× Low ROX or 50×High ROX。

2、PCR反应程序：
注意！本产品预变性反应必须在95℃ 10分钟下完成！

两步法PCR：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	35-40个循环
退火/延伸	60℃	1 min

注意：
1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

更多有关北京实时荧光定量PCR的预混体系(探针法)(高含量ROX校正染料)说明书的价格及使用说明等，请联*(代"系")我们的业务经理王欣女士咨询，我公司还销*(代"售")以下产品：

·抗RFP标签单克隆抗体
编号：WE0339
英*(代"文")名称：Anti RFP-Tag Mouse Monoclonal Antibody
规格：100μl
该抗体为高纯度的鼠单克隆抗体，与RFP结构域具有高亲和性，可灵敏特异地检测各种RFP编码载体表达的RFP-Tag融合蛋白。

抗体类型：鼠单克隆抗体IgG
免疫原：原核表达红色荧光蛋白
应用范围：
WB(1：200-2000)
IP(5μg/mglysate)
Histo/Cytochemistry(1：50-500)

·一步法快速WB试剂盒(兔源一抗)
编号：WE0298
英*(代"文")名称：One Step Western Kit HRP(Rabbit)
规格：50次
  本试剂盒是百奥莱博研发的Western Blot检测试剂盒，能够在1小时左右得到高质量的Western Blot结果，且操作简便、检测灵敏度高、背景低、不需再加入二抗、系统稳定性强。常规的Western Blot间接法检测过程(封闭、一抗结合和二抗结合)需要较长的时间，实验流程复杂且需要多步条件优化。胶上的蛋白转移到载体膜上后，使用试剂盒中的封闭液孵育5 min，再用抗体反应液处理后的一抗孵育载体膜，经洗涤三次(每次5 min)后，即可进行发光或显色检测。本试剂盒针对目的蛋白一抗为兔来源的实验系统使用。
 

组份	50次
Blocking Buffer	500ml
Antibody Pretreat Solution(HRP/Rabbit)	5×1ml
Dilution Buffer	500ml
Wash Buffer(10×)	500ml

注意事项：
1、客户需自己准备兔来源的一抗。
2、使用Blocking Buffer封闭液、Antibody Pretreat Solution(HRP/Rabbit)抗体反应液(兔)、Wash Buffer(10×)漂洗液之前请充分混匀。
3、漂洗液如在2～8℃保存时出现沉淀，请恢复到室温，把沉淀溶解后正常使用，1×漂洗液可在室温保存一个月。
4、建议转膜完成后用丽春红等试剂染色，并把膜上多余部分剪去以增加试剂的使用效率。
5、一抗和抗体反应液HRP(兔)需要通过预实验来确定的稀释用量。
6、抗体反应液HRP(兔)、抗体稀释液和抗体用量可根据膜的大小按比例放大或减少。
7、加入一抗的抗体稀释液可以回收重复使用一次。特异性及亲和力低的抗体不建议重复使用。回收后抗体如在1-2天内使用放置在2～8℃，长期保存请在-20℃冻存，避免多次反复冻融。
8、如果存在较高背景的情况，请调整抗体的用量，并增加洗膜次数。
9、试剂盒内所有试剂请于2～8℃保存，避免冻融。

操作步骤：
本产品适用于转膜完成后的封闭及抗体孵育步骤，以5cm×8cm 膜为例：

1、漂洗液准备：取10ml Wash Buffer(10×)用蒸馏水稀释至100ml，即为1×Wash Buffer，待用。每次洗膜用8-10ml。
2、封闭：转膜完成后，将膜浸没到10ml Blocking Buffer中，室温封闭5分钟。
3、漂洗：倒掉封闭液，加入8-10ml 1×Wash Buffer，于摇床上用较大速度漂洗1分钟。
4、洗膜的同时可准备抗体孵育液：取Antibody Pretreat Solution(HRP/Rabbit)100μl到离心管中，加入兔源一抗3-10μg，枪头吸打至充分混匀，室温孵育5分钟。加入至10ml Dilution Buffer中，充分混匀。
注意：
1)一抗的用量也可根据抗体的稀释度来进行调整。以抗体的稀释度1:1000为例，取100μl抗体反应液HRP(兔)到EP管中，加入10μl一抗，加入到10ml 抗体稀释液中，充分混匀，室温孵育5分钟。
2)如果膜面积较小，可按比例减少抗体、反应液及稀释液的用量。
5、完成步骤3后，倒掉漂洗液，将一抗、Antibody Pretreat Solution(HRP/Rabbit)及Dilution Buffer混合而成的抗体孵育液加到膜上(确保孵育液完全浸没膜表面)，在摇床上以60 rpm左右的速度室温孵育40分钟。
6、弃去(回收)抗体孵育液，用配制的1×Wash Buffer漂洗3-5次，每次3分钟。
7、进行后续检测。建议采用ECL或者DAB法进行检测。

应用实例：


实例一 抗原为293T细胞全裂解液
A：普通WB对照：beta-actin兔多抗 3.3ug 室温孵育40min，洗膜后二抗羊抗兔-HRP(WE0394)1：10000稀释，室温40min，ECL(WE0308)曝光


实例二 抗原为293T细胞全裂解液
C：普通WB对照：PAK1，Epitomics兔单抗1：1000 室温孵育40min，洗膜后二抗羊抗兔-HRP(WE0394)1：10000稀释，室温40min，ECL(WE0308)曝光
D：一步法WB： Epitomics兔单抗1：1000 室温孵育40min，ECL(WE0308)曝光。

常见问题及解决方法：

问题	可能原因	解决方案
信号太弱或者 看不到条带	蛋白上样量太少	进行SDS-PAGE电泳时加大上样量。
	蛋白转膜效率太低	优化转膜时间或者电流，确保转膜时膜与胶之间没有气泡。
	一抗亲和力较低	增加膜在溶液中的孵育时间或者增加抗 体浓度可以增加信号
	一抗亲和力较低	对于低亲和力抗体来说，减少洗膜时间可以增加信号。由每次10 分钟，减少到每次5分钟可以增加信号。
背景偏高	一抗使用过量	减少一抗的使用量。
	一抗有非特异性结合或者 与封闭试剂有交叉反应	使用和二抗来源一致的血清或者无IgG的BSA。
	洗膜时间太短	增加洗涤的步骤可以进一步的降低背景。
	曝光显影时间过长	减少曝光时间。如果信号和背景都高，可以等待一段时间 ，等背景信号减弱后，再进行曝光。
	容器或者试剂被污染	每次洗涤的时候使用清洁的容器。带手套，使用清洁的镊子处理膜。

储存条件：2～8℃保存，避免冷冻


北京实时荧光定量PCR的预混体系(探针法)(高含量ROX校正染料)说明书关键词：高含量ROX校正染料,BaldStar TaqMan Mixture(High ROX),实时荧光定量PCR的预混体系(探针法)(高含量ROX校正染料),WE0146


·抗HA标签单克隆抗体
编号：WE0349
英*(代"文")名称：Anti HA-Tag Mouse Monoclonal Antibody
规格：100μl
该抗体高度特异识别重组蛋白C末端或N末端的HA标签，而不受邻近*基酸组成的影响，可用于检测各种表达载体表达的HA-Tag融合蛋白。

抗体类型：鼠单克隆抗体IgG1
免疫原：人工合成流感病毒血凝素多肽(YPYDVPDYA)
应用范围：
WB(1：500-5000)
ELISA(1：200-20000)
IP(2 µg-5 µg)

·EDTA缓冲液(IHC抗原修复液，50×)
编号：WE0319
英*(代"文")名称：EDTA Buffer(50×)
规格：100ml
  固定时，组织中的许多*基酸残基形成醛键、羧甲键而封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联也使抗原决定簇隐蔽。因此，对于石蜡切片，要求在进行IHC染色前，先进行抗原修复，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，恢复抗原的原有空间形态。EDTA缓冲液是除柠檬酸缓冲液外另一种常用的IHC 抗原修复液。有部分抗原用EDTA缓冲液修复效果好于柠檬酸缓冲液。

注意事项：
1、请使用足量的修复液，修复过程中保证组织切片完全浸没在修复液中。
2、使用沸水浴或高压修复时，操作请务必谨慎，尤其高压修复时，保证锅内有足量的修复液，以防止干烧。
3、推荐的修复时间为达到理想修复效果所需时间，如组织粘片不牢，容易掉片，请酌情减少修复时间。

操作步骤：

1、高压热修复：根据需要量，取适量本品，稀释50倍后即可使用。将稀释好的修复液加入高压锅内，将待修复切片浸于其中，保证修复液没过组织(Z好将切片浸入盛修复液的塑料容器内，再置于锅内修复液浴中)，盖上压力锅盖，加热至均匀喷汽，从喷汽开始计时，1~2 分钟后压力锅离开热源，自然冷却至室温，取出切片，蒸馏水冲洗后，再用 PBS(0.01M pH7.4)漂洗 2 次，每次 3分钟。下接免疫组化染色步骤。此方法修复强度，是Z常用的热修复法。

2、微波热修复：根据需要量，取适量本品，稀释50倍后即可使用。将切片放入盛有修复液的容器中，置微波炉内加热至沸腾，停止加热，使容器内液体温度下降保持在95℃~98℃之间并持续 10~15分钟(注意：请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器，自然冷却至室温，取出切片，蒸馏水冲洗后，再用 PBS(0.01M pH7.4)漂洗 2 次，每次 3分钟。下接免疫组化染色步骤。此方法修复强度大于沸水浴，但小于高压修复。

3、沸水浴热修复：根据需要量，取适量本品，稀释50倍后即可使用。将待修复切片完全浸入盛有修复液的容器中，并将此容器置于盛去离子水的大器皿水浴中，电炉上加热煮沸，从修复液的温度到达95℃起开始计时15~20分钟。让切片在修复液中自然冷却至室温，蒸馏水冲洗，再用 PBS(0.01M pH7.4)漂洗 2 次，每次 3分钟。下接免疫组化染色步骤。该方法效果较微波和高压修复差。

储存条件：2～8℃


北京实时荧光定量PCR的预混体系(探针法)(高含量ROX校正染料)说明书关键词：高含量ROX校正染料,BaldStar TaqMan Mixture(High ROX),实时荧光定量PCR的预混体系(探针法)(高含量ROX校正染料),WE0146

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