小鼠P-Cadherin试剂盒

【类别】   小鼠相关ELISA试剂盒
【英文名】   Mouse P-Cadherin ELISA Kit
【品Pai】   Ybscience/钰博生物
【用途】   仅供科研使用，不得用于临床检验。
【规格】   96T/48T
【种属来源】   小鼠
尊敬的客户，感谢您选用本公司ELISA系列产品，本产品选用世界生产厂家的原料，采用专业体外诊断试剂生产技术制造。适用于体外定量检测小鼠血清、血浆或细胞培养上清液中天然重组小鼠左右决定因子1(P-Cadherin)浓度。仅供科研使用，其他特殊体液标本请咨询。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分。如有疑问，请联系销售小鼠员！
试剂盒组成：

试剂盒组成	48孔配置	96孔配置	保存
说明书	1份	1份
封板膜	2片	2片
密封袋	1个	1个
酶标包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
标准品	0.3ml×6管	0.3ml×6管	2-8℃保存
酶标试剂	5 ml×1瓶	10 ml×1瓶	2-8℃保存
样品稀释液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
显色剂A液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
显色剂B液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
终止液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
20×浓缩洗涤液	15ml×1瓶	25ml×1瓶	2-8℃保存

注：标准品浓度依次从大到小。
相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出！
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心法：抗小鼠左右决定因子1(P-Cadherin)单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的左右决定因子1(P-Cadherin)会与单抗结合，游离的成份被洗去。加入酶标抗体，抗小鼠左右决定因子1(P-Cadherin)抗体与结合在单抗上的小鼠左右决定因子1(P-Cadherin)结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有左右决定因子1(P-Cadherin)，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，左右决定因子1(P-Cadherin)浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中的左右决定因子1(P-Cadherin)浓度。
样品收集:
1. 血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2. 血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会
影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶YZ剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4. 细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
5. 其它生物样品：1000×g离心20分钟，取上清即可检测
6. 样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。
7. 样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融。
8. 如果您的样品中检测物浓度高于标准品值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先做预实验，以确定稀释倍数）。
试验所需自备物品:
1. 酶标仪(450nm波长滤光片)
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水
4. 吸水纸
检测前准备工作:
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。
3. 标准品: 于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度：按照稀释方法图例 标准品&样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL标准品：取0.5mL10ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。  
4. 生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。
5. 酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。当日使用。
标准品稀释方法图例：（以500μL/管为例，也可根据实际用量来稀释，如200μL/管）
 
 洗涤方法:
任何一个成功的ELISA检测，正确的洗板方法是非常关键和重要的一方面。连贯的洗板也很有必要的。在稀释浓缩洗涤液时，请使用去离子水或者蒸馏水。
◆ 洗涤瓶或多通道移液器
保证洗瓶内压强良好或者移液器的管头被适当调整并且无碎屑。检查板内的板条是否安好。将板条编号以防在倾泄的时候松动便于调整。首先，倾泄酶标板以清空内容物。根据试剂盒内推荐的体积向每孔内滴加洗液。若实验步骤中要求浸泡，则定时将每孔浸泡完全。将板内液体倾倒完全，用干净纸巾擦拭。按照说明书所示重复以上步骤。一次洗板之后，将板内液体倾倒完全，用干净纸巾拍打表面并擦干。切勿让孔内干燥。按照试剂盒内说明书迅速进行下一步实验操作。
◆ 自动洗板仪
将自动洗板仪接入适当真空（根据制造商的说明）。确保每管都被适当抽吸。首先，通过吸或者倾倒将板清空。根据试剂盒内推荐的体积向每孔内滴加洗液。若实验步骤中要求浸泡，则定时将每孔浸泡完全。完全抽吸各孔，保证没有洗液残留。在孔内液体被完全抽走之后不要再将装置至于孔内过分抽吸。按照说明书所示重复以上步骤。一次洗板之后，将板内液体倾倒完全，用干净纸巾拍打表面并擦干。切勿让孔内干燥。按照试剂盒内说明书迅速进行下一步实验操作。
操作步骤:
实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液 100μL，余孔分别加标准品或待测样品 100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育 90 分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液 100μL（在使用前15 分钟内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育 1 小时。
3. 弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，大约 350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
4. 每孔加酶结合物工作液（临用前 15 分钟内配制）100μL，加上覆膜，37℃温育30 分钟。
5. 弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，方法同步骤3。
6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15 分钟左右（根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30 分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。
7. 每孔加终止液 50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
8. 立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度（OD 值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
9. 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。
注意事项：
◆ 仔细阅读说明书。
◆ 检查试剂盒标签上的有效期。如果超过有效期，请勿使用。
◆ 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积）。
◆ 标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备（贮存），尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存。
◆ 准备好所有实验额外所需物品，（比如移液器，试管，清洗器，酶标仪）。
◆ 按说明书将所用试剂平衡至室温，根据检测标本数量确定所需试剂的量。
◆ 检查试剂盒内每种试剂的贮存条件，保证所有试剂均按照试剂盒内说明书推荐的条件存储。
◆ 检查不稳定或者变质的试剂溶液（比如沉淀或变色）。有些试剂，比如标准品稀释液或者检测稀释液，可能在设计时就含有沉淀物。所有试剂在滴入酶标板之前，必需充分混匀。而由于沉淀物的特性，在加入酶标板之前，必需不停搅拌。
◆ 保证充分的孵育时间和温度。
◆ 切勿使用不同生产批号的试剂取代现有试剂或混合现有试剂。
◆ 在混合或溶解蛋白溶液时，避免泡沫产生。
◆ 在实验开始之前，安排好实验流程。
◆ 在实验开始之前，清洁工作台。
◆ 若有问题，应与我公司或代理商的技术支持联系  
结果判断:
1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。
2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
特异性和重复性:
● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。
● 特异性:可检测重组或天然的小鼠左右决定因子1(P-Cadherin)，且与其它相关蛋白无交叉反应。
操作概要
1. 在各孔中加入标准品或样品各 100μL， 37℃孵育 90 分钟
2. 倒去孔内液体，加入 100μL 生物素化抗体工作液，37℃孵育 60 分钟
3. 洗涤 3 次
4. 加入 100μL 酶结合物工作液， 37℃孵育 30 分钟
5. 洗涤 5 次
6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分钟左右
7. 加入 50μL 终止液，立即在 450nm 波长处测量 OD 值
8. 结果计算  
问题分析
若实验效果不好，请及时对显色结果拍照，保留所用板条及未使用试剂，并妥善保存，然后联系我公司技术支持为您解决问题。
我是按照实验步骤进行测定的，但是没有任何信号，为什么？
◆ 对于使用HRP底物的比色测定，终止液的加入会使底物变色。而说明书推荐的波长就是Z适波长。
◆ 通过轻拍酶标板的边缘充分混合孔内试剂。加入终止液的时，颜色由蓝变黄（如果是HRP底物）。如果加终止液之前孔内试剂没有混合，则底物颜色变绿。
◆ 可能加入试剂的顺序错误。
◆ 加入底物溶液以后不要清洗酶标板。
◆ 在连续稀释时确定已经加入标准品。
◆ 如果底物系统中有两个成分，则必需混合均匀。
◆ 确定酶标仪的使用和操作正确。
◆ 确定试剂，标准品，样品都正确配制并按照说明滴加无误。
◆ 对于高敏感性试剂盒，确定使用的底物和放大剂都正确稀释。