特别提示：包括阿利辛蓝-过碘酸雪夫染色试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！
产品名称：阿利辛蓝-过碘酸雪夫染色试剂盒
英文名称：AB-PAS Stain Kit
产品货号：SY0596
产品规格：20ml×4
糖原染色是病理学中常规的染色方法之一，高碘酸-雪夫技术是McManus在1946年使用的，常用来显示糖原和其他多糖，而且还能显示中性黏液性物质和某些酸性物质。阿利新蓝和PAS技术联合使用可鉴别同一组织切片中的中性粘液和酸性粘液。
阿利新蓝（又称阿尔辛蓝、爱先蓝），是类铜钛花青染料，这种阳离子染料与酸性基团结合，即阿利新蓝与组织内含有的阴离子基团如羧基和硫酸根形成不溶性复合物，可将唾液黏蛋白、硫黏蛋白和蛋白多糖染成蓝色。PAS技术可将中性粘液染成红色，由于阿利新蓝与雪夫试剂结合并发生反应，又将既含中性粘液又含酸性粘液的组织和细胞染成深浅不同的紫色。，实验结果中酸性粘液物质呈蓝色，中性粘液物质呈红色，混合粘液物质呈紫红色，细胞核呈浅蓝色。
产品组份：
阿利新蓝染液（蓝色液体）————20 ml
高碘酸溶液（无色液体）—————20 ml
雪夫试剂（淡红色液体）—————20 ml
苏木素（紫红色液体）——————20 ml
注意事项
1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）试剂盒临用前前半小时取出恢复室温，用后应放回冰箱保存。
3）雪夫试剂染色时间不宜过长，一般组织变色后即可。
4）苏木素复染细胞核时应淡染，这样与阿利新蓝容易区别，也可以选择不染。
储存条件：室温，有效期36个月
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名称：脱脂奶粉
货号：BTN130907
规格：50g
本产品为分子生物学级脱脂奶粉，可广泛用于Southern、Northern和Western印迹杂交实验的封闭试验。
储存条件：常温运输和保存、有效期半年。
名称：超级杂交液(含50%甲酰胺)
货号：BTN80915B
规格：100mL
核酸杂交一般是指用一种标记的核酸探针与印迹膜上的核酸进行杂交，由此检测印迹膜上是否存在与探针同源的核酸分子(靶分子)。核酸杂交是分子生物学的基本技术之一，应用非常广泛。由于核酸杂交效率受印迹膜种类、杂交温度、探针浓度、杂交液离子强度、杂交液pH及杂交液粘度等因素影响，用户自己摸索和优化相关条件非常繁琐，因此本公司开发了本产品，其操作流程如下：
产品特点：
1. 既可用于Southern杂交(靶分子为DNA)，也可用于和Northern杂交(靶分子为RNA)，还可以用于菌落杂交，基因芯片等杂交。
2. 既可以用于同位素探针的杂交，也可以用于非同位素探针的杂交。
3. 既可以使用DNA(包括DNA Oligo)探针，也可以使用RNA探针(包括RNA Oligo)
4.含多种能够促进杂交的聚合物，使杂交反应能在6～12小时完成，而常规杂交反应一般需要12～24小时。
5.含多种封堵剂，能阻印迹膜对探针分子的非特异性吸附，能有效降低背景信号，延长曝光时间以便检测到低拷贝的RNA(Northern)和单拷贝的基因(Southern)。
6. A型不含甲酰胺，B型含50%的甲酰胺。后者使杂交在较低温度就可以完成，适合Tm 较高的分子杂交(如RNA-RNA和RNA-DNA杂交)。
7.跟各种常用的印迹膜兼容，包括硝酸纤维素膜和尼龙膜。
储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。本产品属于高盐溶液，低温下产生沉淀，必须在65℃加热溶解并充分摇匀后才能使用。
使用方法：
一、根据探针和靶分子的不同，分别按下面不同情况计算杂交分子的Tm 值
1. 对DNA-DNA杂交，其Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+] + 0.41×GC%–500/L
说明：L是探针或靶分子的长度(用两者中Z短的一个)
GC%是探针或靶分子中的GC 百分比(用两者中Z短的一个)
Na+浓度是本产品中Na+的浓度，为0.75 M，16.6 ×log10[Na+]=(-2.07)
2. 对DNA-RNA杂交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高10-15℃。
3. 对RNA-RNA杂交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高20-25℃。
4. 对Oligo探针杂交，Tm=GC 数量×4℃+AT 数量×2℃。
二、确定杂交温度(预杂交温度跟杂交温度应该一样)
1. 对于大于200bp的DNA-DNA杂交，杂交温度一般比Tm低15-25℃，一般选择68℃。
2. 对RNA-RNA或DNA-RNA杂交，杂交温度一般比Tm低15-25℃。如果这样计算出的杂交温度很高(如高于70℃)，则RNA容易降解，所以Z好选用含甲酰胺的超级杂交液(B型本产品)，以便能在42℃完成杂交。
3. 对Oligo探针的杂交，杂交温度一般比Tm低5℃。由于Oligo较短，更容易受各种因素影响(如错配率、修饰碱基比例等)，所以温度需要适度摸索和优化。
三、确定洗膜温度
一般使用0.1×SSC做洗膜液，在此条件下的洗膜温度比Tm低5-12℃，一般情况下可以在55℃进行洗膜。Oligo探针可以室温洗膜。
四、预杂交步骤
预杂交就是用不含探针的本产品跟印迹膜进行孵育，其目的是用所含的非特异性DNA分子(鲑精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物将印迹膜上会非特异地吸附探针分子的位点封闭，否则这些位点会吸附标记的探针，造成高背景。
1. 将结合了靶分子的硝酸纤维素印迹膜或尼龙印迹膜浸泡于自备的6×SSC溶液中，使其充分湿润。
2. 将湿润的印迹膜置于一塑料杂交袋中(塑料袋Z好预先封口，再剪掉一角，留一个小口)，按每平方厘米印迹膜加0.2mL超级杂交液的比例沿小口加入超级杂交液，然后用塑料封口机将口封牢。
3. 将此塑料袋浸没入温度设定在杂交温度的恒温水浴中或杂交炉中，保温1-2小时，延长到12-16小时亦可。注意保温过程中塑料袋应在不停的摇动状态中，使超级杂交液与印迹膜充分接触。
五、杂交步骤
1. 如果标记的探针是双链核酸，则需经变性处理。具体操作是将探针样品在沸水浴中加热5分钟，然后迅速置冰浴中。如果是单链DNA或RNA探针，则不需变性，直接使用。
2. 将单链探针或变性后的双链探针加入到完成了预杂交的杂交袋中(先用剪刀剪一小口，加入探针后用热封机封口)。探针的加入量视探针标记效率而定，一般要求终浓度不能低于1-2 ng/mL。如果检测基因组中的单拷贝基因，探针的加入量应加大，而对于检测克隆的基因片段，则探针的量可减少。如果是放射性探针，应将此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免杂交袋发生遗漏、污染工作环境。
3.在选定的杂交温度下继续保温，时间一般为6-12小时。
六、洗膜步骤。注意在下面的所有操作过程中，一定不要使印迹膜干燥。
此步是将与印迹膜非特异结合的探针分子洗去而只留下特异结合的探针分子。由于非特异性杂交的杂交分子解链温度较低，热稳定性较差，在一定的温度和较低的离子强度下，即可洗掉。
1.杂交完毕，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探针的杂交液。此含探针的杂交液可以多次使用再倒弃。
2. 剪开杂交袋，用镊子取出印迹膜，浸没于大量的2×SSC(含0.5%SDS)溶液中，室温下振荡漂洗15分钟。
3. 重复上步操作一次。
4. 将印迹膜转移至0.1×SSC(含0.1% SDS)溶液中，在计算好的洗膜温度下振荡漂洗30分钟至1小时。
5. 重复上步操作一次。如果是同位素标记探针，则需要重复至用盖革计数器在无核酸区域检测不出放射信号为止。
6. 将印迹膜转移到滤纸上，吸去表面液体后印迹膜即可用于后续检测。
疑难解答：
问题一：高背景(有或没有杂交信号)
解决方案：将放射性探针的比活降低到2×10E6 cpm/mL以下；将非放射性探针的终浓度降低到30 ng/mL以下；将探针长度控制在200–800 核苷酸；减少杂交时间；适当提高杂交温度。
问题二：没有杂交信号或杂交信号非常弱
解决方案：杂交过程中应应该连续振荡，不应该有气泡，避免印迹膜变干。将放射性探针活性提高到>5×10E8 cpm/ng，提高非放射性标记探针的终浓度；适当降低杂交温度。
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