StarScript II DY链cDNA合成混合体系_详细资料

产品信息

StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix

货号

规格

价格

A214-02

20 rxn

305元

A214-05

50 rxn

686元

产品信息

【产品概述】

本产品是专为两步法RT-PCRDY步实验设计的高灵敏度反转录反应预混体系，可以从极低量的总RNA或poly(A) mRNA合成DY链cDNA，无需额外添加RNaseYZ剂,合成的cDNA产量更高，长度可达15 kb。使用方便，对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，适合于各种耐热DNA聚合酶。

【产品组分】

组分名称

A214-02

A214-05

StarScript II RT Mix

20ul

50 μl

2×Reaction mix

200ul

500 μl

Oligo (dT)₁₈(50 μM)

20ul

50 μl

Random Primer (50 μM)

20ul

50 μl

DEPC-ddH₂O

1ml

2.5 ml

【保存条件】

－20℃恒温保存，有效期一年。

【使用方法】

A．注意事项

1.     实验过程中请注意避免RNase污染。

2.     除酶以外的各种试剂，使用之前请完全溶解并充分混匀，以防因盐离子浓度不均影响实验结果。

3.     RNA模板的完整性对cDNA合成效率起着决定性作用，因此请选择可靠的RNA提取/纯化方法。建议使用GenStar TRIGene总RNA提取试剂 (货号P118-02) 制备高质量的RNA模板，并设置反转录反应阳性对照。

4.     由于所有的RNA提取方法都不能完全去除基因组DNA，所以应根据后续实验的需求，选择是否需要在反转录反应前去除残留基因组DNA。RNase-free DNase I (货号A216-01) 处理的具体方法见本说明书附录。

5.     StarScript II RT Mix以RNA为模板获得全长的DY链cDNA，其起始位点由所用引物所决定：

1)     随机引物 (Random Primer) 在RNA模板上没有特异性结合位点，所有RNA都可以做为DY链cDNA合成的模板；

2)     Oligo dT Primer只能以poly(A) mRNA作为cDNA合成的模板；

3)     采用序列特异性引物 (GSP) 以其结合位点为起始位点。

6.     StarScript II RT Mix合成的DY链cDNA产物可直接加入PCR反应混合物中进行扩增，但加入体积不应超过PCR反应总体系的10%，否则影响目的片段的产量。PCR扩增使用的耐热DNA聚合酶和热循环条件需要根据目的片段的大小、GC含量、引物特性、以及对保真度的要求等进行选择。

7.     DY链cDNA合成产物经过处理后可作为第二链合成的模板，合成含各种标记的cDNA，作为杂交实验的探针。

8.     RNA可置于-70℃以下长期保存，cDNA合成产物可置于-20℃保存。

B．标准操作流程

1．  按照下表配制反应体系

1）RNA模板：                  ≤8 μl

                            总RNA                                 1~5 µg

                            poly(A)mRNA                     0.1~0.5 µg

2）引物

Oligo (dT)₁₈(50 μM)            1ul

或者Random Primer (50 μM)    1ul

3）2×Reaction mix             10ul

4）StarScript II RT Mix          1ul

5）DEPC-ddH₂O 补足至        20ul

2．  轻轻混匀

如用Oligo (dT)₁₈(50 μM)，42℃孵育50min

如用Random Primer (50 μM)，25℃孵育10min，42℃孵育50min

3．  85℃加热5分钟失活StarScript II RT Mix。

C．补充操作流程 (适于复杂模板或对扩增产量要求较高的实验)

1．  在DNase/RNase-free离心管中加入下列成分：

1)     RNA模板：      ≤8 μl

                            总RNA                                 1~5 µg

                            poly(A)mRNA                     0.1~0.5 µg

2)     引物：                            1 μl

    Oligo dT Primer                  50 μM

        或 Random Primer           50 μM

        或序列特异性引物            20 μM

3)     DEPC-ddH₂O补足至                 9 μl

2．  混匀，短暂离心，65℃加热5分钟，打开RNA的二级结构；

3．  立即置于冰上至少1分钟，避免RNA的二级结构重新形成；

4．  向管中加入：

2×Reaction mix                  10 μl

StarScript II RT Mix             1 ul

5．  轻轻混匀， 42℃温浴50分钟；

6．  85℃加热15分钟使酶失活；

7．  置于冰上进行后续实验或冷冻保存。

【补充说明】

1．RNase-free DNase I (货号A216-01) 处理RNA模板的方法：

1) 在DNase，RNase-free离心管中加入下列试剂：

RNA                                             5 μg

10 X DNase I buffer                     0.8 μl

DNase I (2 U/μl)                          0.5 μl

RNase Inhibitor                           0.25 μl

DEPC-ddH₂O                              补足至8 μl

2) 混匀，短暂离心，37℃放置30分钟；

3) 加入0.25 μl 150 mM EDTA，65℃放置15分钟使DNase I失活。

2．去除DY链cDNA合成产物中的RNA方法：

1) 加入2 μl RNase H (货号A217-01)，混匀，短暂离心，70℃放置20分钟；

2) 取5 μl RNase H处理的cDNA，加入95 μl ddH₂O (即稀释20倍)；

3) 取2 μl稀释后的cDNA作为模板用于PCR扩增。

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组分名称	A214-02	A214-05
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