全基因组表达谱基因芯片/技术服务

全基因组表达谱基因芯片/技术服务

康成生物为您提供全基因组表达谱芯片技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，康成的芯片技术服务人员就可为您完成全部实验操作，并提供完整的实验报告。同时，根据您的研究需要，康成还提供基因网络关系分析、分子标志物筛选分析等数据挖掘服务。

Roche-NimbleGen表达谱芯片
*  无膜芯片合成技术：为客户提供ZX的芯片设计、高重复性的芯片制作和高可信度的统计结果。
*  使用60mer长度的寡核苷酸探针：与短探针相比，具有更高的信噪比、灵敏度、专一性和辨别能力。
*  单基因多探针设计：芯片上的单个基因设计了3-5个探针，提高了芯片检测的准确性，平均数据有更可靠的统计学意义。

康成客户实例----Roche-NimbleGen全基因组表达谱芯片
Histone H4 Lys 20 monomethylation by histone methylase SET8 mediates Wnt target gene activation. PNAS, 2011
文章作者主要对SET8（组蛋白甲基化修饰酶）在Wnt信号通路中的作用进行了研究。通过NimbleGen表达谱芯片筛选SET8正常表达与表达YZ两组293细胞中的差异基因，发现其中有24个基因是Wnt信号通路靶基因（见下图），表明SET8在这些靶基因的表达调控中起作用。进一步研究发现wnt3a刺激后，Wnt信号通路靶基因的启动子区域H4K20me1修饰上调。作者提出了SET8通过调节组蛋白甲基化修饰ZZ导致Wnt信号通路靶基因表达改变的分子机制。

上图：24个Wnt信号通路相关基因的聚类图。红色代表上调，绿色代表下调。
 

Roche-NimbleGen还提供斑马鱼、杨树、拟南芥、线虫、果蝇、酵母及原核生物等多类物种的表达谱芯片。其中原核生物芯片种类最为广泛，有三百余种供选择。

Agilent表达谱芯片

Agilent公司的原位喷墨专利技术（SurePrint）可以灵活地、大规模地原位合成60mer的寡核苷酸探针，每个探针的设计都要经过反复试验筛选优化。2006年美国FDA发表的现主流芯片平台评估报告MAQC中，Agilent array 的C-V值、检测基因数目、与Taqman探针的重复性均处于国际同行业领先水平， 在国际论文期刊上，也有很多利用Agilent array平台发表的高质量文章。

康成客户实例----Agilent全基因组表达谱芯片:

Calcium Prevents Tumorigenesis in a Mouse Model of Colorectal Cancer. PLOS One, 2011

结肠癌（CRC）是目前全世界发病率ZG的癌症之一。作者以DMH(1,2-二)构建小鼠结肠癌模型，并且在饮食中加入了含高浓度钙的化合物，通过全基因组表达谱芯片筛选发现，相比于结肠癌模型组，钙处理组有549个基因发生了显著性差异变化（Fold change>1.5 & P<0.05）通过进一步功能基因表明，钙处理后能导致一些与肿瘤转移、细胞周期、细胞分化、凋亡、Wnt等信号通路中相关基因表达下调，比如S100a9、MMP家族蛋白等，从而有效地阻止结肠癌的转移。

上表：利用Agilent表达谱芯片筛选出钙处理前后结肠癌小鼠表达改变最明显的部分差异基因，并从中挑选部分进行验证
下表：对下调基因进行pathway分析发现，主要是Wnt、细胞周期等与肿瘤转移及癌症相关信号通路高度富集

Agilent还提供多类物种的表达谱芯片：
动物：兔、猪、斑马鱼、果蝇等            植物：水稻、玉米、拟南芥、烟草等           
微生物：大肠杆菌、酵母等


康成生物全基因组表达谱芯片主要实验流程
1. 样品RNA抽提：
a. 实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen），使用Mini- Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA
b. 实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿TRIzol使用量为1ml），裂解后抽提RNA
2.  RNA质量检测：
a. 使用Nanodrop测定RNA 在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度
b. 用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性
c. 提供RNA QC报告
       注意：用于芯片检测的RNA样品，必须是高质量的，完整的，没有RNase污染（降解的样品不能用于标记和芯片检测），没有基因组污染。
3. cDNA/aRNA样品合成和标记
4. 标记效率质量检测：
      使用Nanodrop检测荧光标记效率，标记效率合格以保证后续芯片实验结果的可靠性
5. 芯片杂交：
      在标准条件下将标记好的探针和高密度基因组芯片进行杂交
6. 图像采集和数据分析：
      使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算
7. 提供实验报告 包括详细的实验方法以及芯片实验数据和图表，以双色标记实验为例：
Scanning Image: Cy3、Cy5荧光扫描图像
Scatter Plot: 散点图，X轴为Control（Cy3）数据值，Y轴为Exp(Cy5)数据值，表示芯片上两通道数据总体分布集中趋势；
MA-plot: MA图，X轴为A值[log2(Exp)+log2(Control)]/2，代表点的整体信号强度，Y轴为M值log2(Exp)－log2(Control)表示点的两通道信号差，可由MA图观察芯片数据是否存在强度依赖的系统偏移以及信号差异点的比例
Raw Data: 探针的扫描荧光信号强度原始数据
Normalized Ratio: 原始数据经过统计学方法标准化后的比值的对数，log2(Exp/ Control)
p –value: T-test统计分析显著差异表达的基因，p-value越小，该基因在两样本间差异表达越显著
Significant Up & Down Regulated Gene List: 给出Fold Change>=2，p-value<0.05的基因列表

康成生物全基因组表达谱芯片数据常规分析
1. 统计学分析
对于每个实验组有三次以上生物学重复的实验设计，我们应用T检验筛选任意两个实验组之间差异表达的基因。方差分析（ANOVA）则用于从三个以上实验组筛选差异表达的基因。
2. 聚类分析
聚类分析根据样本表达谱的相似性将样本划分成不同的组别（见下图，Alizadeh, et al.）。常用的聚类方法有：Hierarchical(层次聚类)、K-means（K均值聚类）、SOM（自组织映设）、QT clustering。


3. GO分析
GO分析对差异表达基因的生物学功能进行注释，并筛选出在两个实验组之间具有显著差异GO条目（见下图）。GO条目从生物学过程（Biological Process），分子功能（Molecular Function）和亚细胞组分（Cellular Component）三个方面对基因的功能进行分类。

4. Pathway分析
Pathway分析可以筛选出在两个实验组之间具有显著差异的信号转导通路（见下图）。信号转导通路主要来自KEGG数据库。

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