Malachite Green ELISA kit/孔雀石绿检测试剂盒

孔雀石绿检测试剂盒说明书  使用之前要读说明书(中文说名书仅供参考请以英文为准) 适用 本试剂盒适用于水产品中孔雀绿的定量检测。 原理 本试剂盒原理是竞争酶联免疫检测方法，利用萃取剂从样品中提取到孔雀石绿. 在固相载体微孔板中加入标准和处理的样品，然后加入孔雀石绿抗体，反应30分洗孔，然后加入HRP标记的孔雀石绿孵育30分后洗板，洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的孔雀石绿浓度与吸收光强度成反比 。 特异性 与孔雀石绿类似物的交叉反应 

Malachite green 孔雀绿
Leucomalachite 隐色孔雀绿	1%
Crystal Violet 结晶紫	120%
Leucocrystal Violet 隐色结晶紫	2%

  检测限 水产品: 0.5 ppb 试剂盒组成 96孔酶标板：1块(8×12条)。 标准品贮备液(Standard): 1瓶(0.4ml/瓶)，100ppb。 酶标记物：1瓶(25倍, 0.8ml)HRP标记的孔雀石绿结合物 孔雀石绿抗体：1瓶(9ml) 底物显色液：1瓶(16ml) 终止液：1瓶(12ml 、1N HCl)。 结合物稀释液：1瓶(15ml)。 样本稀释缓冲液：2瓶(25ml) 浓缩洗涤液：1瓶(5倍， 100ml/瓶)、酶标板的洗涤。 使用说明书 注意   不要使用过了有效日期的孔雀石绿检测试剂盒，不同批次、不同试剂盒之间的试剂等内容不可混用。不使用被污染和稀释的试剂。使用前将所有的试剂拿到室温(20℃-28℃)，但不要超出24小时。孔雀石绿是抗生素应小心对待。终止液为1M的盐酸避免接触皮肤，如果不小心滴到皮肤上要马上用水清洗。洗液是5乘的在使用时要稀释。还需设备 l         去离子水或重蒸水 l         100ml或更大的量筒 l         样品提取和采集用的玻璃器皿 l         甲醇 l         25、50、100 和250μL 单道或多道移液器 l         计时器 l         旋涡混合器 l         洗瓶 l         吸水纸 l         离心机 l         450nm 滤光片的酶标仪  样品制备(肉 1:20 稀释) 1 鱼虾去皮取肉，用匀浆器均质样品，称取5g均质好的样品置于离心管中2 加入10 mL乙腈，振荡器震荡30分3 4000g离心10分钟 4 轻轻倒出上清, 移入到另一个离心管。 5 用3ml乙腈活化氧化铝柱(1-2滴/秒)。6 取3ml样品过柱。7 收集样品于一干净试管中。8 加入3ml乙腈洗柱并收集与上述步骤7试管中。 9 利用样品稀释液1：10的比例稀释洗脱物(50ul+450ul)，待用。 第二种前处理方法： (1:10 稀释) 1. 样品均质后称取4g于离心管中； 2. 加入5ml 0.2MHCL，充分混合5min；室温2000g离心5min 3. 吸取2.5ml上清液，加入5ml二氯甲烷 ，充分振荡2分钟； 4. 室温2000g离心5min，去除上层液体； 5. 转移2.5ml下层液体于另外一只玻璃试管中，50-60℃氮流蒸发； 6. 残留物溶于2ml乙腈，摇匀； 7. 用样品稀释液将混合洗出液稀释10倍(50ul乙腈提取液+450ul样品稀释液)； 8. 移取75ul进行分析。 酶交联物制备 试剂盒提供的酶交联物是25倍的，每次使用前都要稀释。标准稀释液的制备

乙腈和样品稀释液1:9的比例混合使用 标准品浓度(ppb)	标准品稀释液(ml)	标准品
1	8ul + 792ul标准品稀释液	800uL
0.5	200ul +200ul标准品稀释液	400uL 0.5ppb的标准液
0.1	100ul +400ul标准品稀释液	500uL 0.1ppb的标准液
0.05	200ul +200ul标准品稀释液	400uL 0.05ppb的标准液
0.01	100ul +400ul标准品稀释液	500uL 0.01ppb的标准液
0	200ul标准品稀释液	0

 操作步骤 1.      用前将试剂盒和样品处理物提前从冰箱中拿出来使其达到室温。装有洗液的洗瓶。  2．从铝箔袋中拿出要求数量的微孔条，放入干燥剂并重新封好袋子以免微孔条受潮。 3. 用移液器吸取75 μl 样品处理物到对应的测试孔 ，同时在每个孔中都加入75 μl 抗体溶液。 4. 轻轻震动30秒使其混匀孵育30分。 5. 孵育完成后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板缓冲液清洗微孔。每孔每次至少加入250ul，微震荡洗涤后倒掉，重复三次，总共四次洗板。拍板，去掉残留的洗液。 6. 每个孔加入150 μL 酶标结合物. 7. 轻轻震动30秒使其混匀孵育30分 8. 孵育完成后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板缓冲液清洗微孔。每孔每次至少加入250ul，微震荡洗涤后倒掉，重复三次，总共四次洗板。拍板，去掉残留的洗液。 9. 每个孔加入150 μL 底物.孵育30分 10. 每孔加入 100 μL 终止液. 11. 450nm 下读取每个孔的吸光度值(OD) 结果分析 1、半定量结果的判定，可根据样品的吸光度值与标准的吸光度值来判定，样品的吸光度值低于某个标准的吸光度值，则说明样品的孔雀石绿含量大于此标准的浓度，样品的吸光度值高于某个标准的吸光度值，则说明样品的孔雀石绿含量小于此标准的浓度。2、定量结果判定，需要以标准的吸光度值为X轴，标准浓度的对数为Y轴绘制曲线图，将标准浓度吸光度值的点用直线连接，样品的吸光度值也位于这条直线上，根据样品的吸光度值在Y轴上即可找到相应样品的浓度，如果样品的吸光度值大于Z小标准的吸光度值或小于Z大标准的吸光度值，即可说明此样品中孔雀石绿的含量小于0.01ppb或大于1ppb。 3、  当样品的浓度高于1ppb 时要调节稀释倍数来获得终的浓度。 

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