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名称:RNase H
编号:YT511
产地:国产|进口
规格:100U
品Pai:百奥莱博
英文名:Ribonuclease H
本酶是一种核糖核酸内切酶,可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNase H不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键,即不能消化单链或双链DNA或RNA。
特点:特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA,常用于cDNA第二链的合成。
用途:DNA-RNA杂合链中去除RNA,例如cDNA第二条链合成前去除mRNA;通过互补的DNA序列实现对RNA的定点剪切;除去杂交到poly(dT)上的mRNA中的poly(A);体外多腺苷酸化反应(polyadenylation reaction)产物研究。
来源:E.coli MRE-600细胞。
分子量:约18.4kDa(单体)。
活性定义:37℃20分钟内,能够催化1nmol杂合双链中的RNA形成酸可溶性核糖核苷酸形式所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件:20mM Tris-HCl(pH7.8),40mM KCl,8mM MgCl2,1mM DTT,24μM[3H]-poly(A).poly(dT),0.03mg/ml BSA ,4%(v/v)glycerol。
纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含其它核糖核酸酶。
酶储存溶液:25mM HEPES-KOH(pH8.0),50mM KCl,1mM DTT,1mM EDTA,0.1mg/ml BSA,50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X):200mM Tris-HCl(pH7.8),400mM KCl,80mM MgCl2,10mM DTT。
失活或YZ:65℃加热10分钟可使RNase H失活。金属离子螯合剂和巯基封闭剂均能YZRNase H活性。
储存条件:-20℃。
使用说明:
1. DNA-RNA杂合链中去除RNA:
a. 用反转录酶,例如RT M-MuLV反转录酶或RT M-MuLV反转录酶(RNase H-)合成cDNADY条链,70℃孵育10分钟终止反应。
b. 在冰浴上向已经合成DY条链的20µl反应体系中依次加入如下试剂:
Reaction Buffer (10X)————2µl
无核酸酶去离子水——————217.8µl
RNase H (5U/µl)——————20.2µl
c. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在ZD速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
d. 37℃孵育1小时。
e. 加入2.5µl 0.5M EDTA(pH8.0)混匀,以终止反应。
f. 后续可以使用酚*仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化合成的双链cDNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。
说明:其他情况DNA-RNA杂合链中去除RNA的条件可以参考上述条件进行。RNase H反应的pH范围约在7.5-8.3均可。
2. 杂合链中RNA的去除和cDNA第二链的合成:
a. 用反转录酶,例如RT M-MuLV反转录酶(YT392)、RT M-MuLV反转录酶(RNase H-)(YT393)或cDNA DY链合成试剂盒(RNase H-)(YT395)合成cDNADY条链,70℃孵育10分钟终止反应。
b. 在冰浴上向已经合成DY条链的20µl反应体系中依次加入如下试剂:
Reaction Buffer (10X) for DNA Polymerase I————8µl
无核酸酶去离子水—————————————————68.8µl
RNase H (5U/µl)—————————————————0.2µl
DNA Polymerase I, E.coli—————————————3µl (30U)
c. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在ZD速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
d. 15℃孵育2小时。(注意:反应温度不能超过15℃)
e. 加入5µl 0.5M EDTA(pH 8.0)混匀,以终止反应。
f. 后续可以使用酚*仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化合成的双链cDNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。
注:Reaction Buffer (10X) for DNA Polymerase I:500mM Tris-HCl(pH 7.5 at 25℃),100mM MgCl2,10mM DTT。
3. 其他用途请参考上述用途或相关文献资料进行。
关键词:Ribonuclease H,YT511,RNase H
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