TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)促销

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、YL及其他非科研用途。

北京百奥莱博主要从事生物试剂的生产和销*(代"售")，产品线涵盖TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)促销在内的分子生物学试剂产品，还包括PCR及荧光定量PCR、核酸提取试剂盒类、样本核酸保护试剂、核酸提取、克隆与转化、蛋白纯化、蛋白检测、免疫组化、细胞凋亡与抗体等。

名称：TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)促销
英文名：pUC-T Simple TA Cloning Kit
品Pai：百奥莱博
规格：20次
产地：国产|进口
  pUC-T Simple载体是一种GX克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在EcoR V酶切位点处切开，在两侧的3＇端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3＇端添加一个A，可以与pUC-T 3＇端的T互补连接，同时它消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时，酶切反应将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。
  试剂盒中配备GX率的T4 DNA Ligase和为快速GXDNA连接优化的2×Quick Ligation Reaction Buffer。连接效率相当于用T4 DNA Ligase 进行常规连接1小时。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物对PCR产物进行测序。

试剂盒组成：

 

组份	20次
pUC-T Simple(50 n g/μl)	20μl
Control Insert(50ng/μl)	10μl
Quick T4 DNA Ligase	20μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	120μl

注意事项：

1、Insert DNA 要求
1)连接使用的PCR片段3’末端应带有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的Pfu扩增的PCR产物是平滑末端，可使用加A试剂盒加上A尾后，再进行T载体克隆。
2)PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆，以免PCR产物中的非特异片段或残存引物等杂质影响。推荐使用WE0168快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

2、连接反应要求
1)本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点，增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应1小时后，转化效率会明显降低；如25℃快速连接反应过夜，则转化效率会下降到75%。
2)2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混匀，建议初次使用分装成小管冻存，避免其反复冻融影响DNA连接效率。
3)由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用之前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深，以免粘在枪头上造成损失。
4)如快速连接产物用于电转，因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率，建议使用离心柱将连接产物进行DNA纯化(如WE0170快速DNA产物纯化试剂盒)后再进行电转。

3、感受态细胞要求
建议使用GX的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型(F´编码的【lacZ ΔM15】)产生ω片段，才能与载体DNA产生的LacZ α 多肽结合，表现出β-半乳糖苷酶活性(α互补)。pUC-T Simple载体以pUC18载体为基础构建而成，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用。推荐使用本公司WE0251 TOP10感受态细胞、WE0252 DH5α感受态细胞。

4、阳性克隆筛选
阳性DNA片段成功插入至pUC-T Simple Vector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。

5、阳性对照
为了确认实验操作的正确性，以及实验试剂的有效性，我们建议使用本试剂盒中配备的Control Insert(750 bp)进行阳性对照实验。

使用方法：

1、按以下体系配制反应液：

成分	反应体系	对照体系
pUC-T Simple(50ng/μl)	1μl	1μl
DNA 插入片段 *	0.1 -0.3 pmol	--
Control Insert DNA	--	1μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	5μl	5μl
Quick T4 DNA Ligase	1μl	1μl
RNase-Free Water	补足至10μl	补足至10μl

Insert DNA的使用量：在进行克隆时，Vector DNA和 Insert DNA的摩尔比一般为：1:2-1:10，可根据实验情况选择适当的Vector DNA和 Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA的使用量=nmol数×660×Insert DNA bp数。本载体1μl(50ng)的摩尔数约为0.03 pmol。

2、轻轻混合，短暂离心。25℃反应5分钟。
注意：反应时间不要超过15分钟，否则会降低连接效率。
3、反应结束后，将DNA连接产物存放于0-4℃，而后进行转化实验；也可将DNA连接产物置于-20℃保存。
注意：勿进行加热失活反应。
4、将连接产物加入50μl感受态细胞中(将感受态细胞置于冰上融化)，冰浴30分钟。
注意：用化学法转化时，连接产物的加入量不要超过感受态细胞体积的10%。
5、42℃热击45秒钟，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
6、加入450μl无菌SOC或LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟，使菌体复苏。
7、根据实验要求，取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16小时。
8、计算白、蓝色菌落，挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。




储存条件：-20℃。

更多有关TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)促销的价格及使用说明等，请联系我们的业务经理王欣女士咨询，我公司还销*(代"售")以下产品：

·磁珠法琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
编号：WE0206
英文名称：MagBeads Gel DNA Extraction Kit
规格：96次
  本试剂盒提供了一种简单、快速、GX的用于琼脂糖凝胶DNA回收的方法。它可以从用TAE或TBE制成的琼脂糖凝胶中回收100 bp以上的DNA片段，回收效率高达80%。溶胶液将琼脂糖胶溶解后，磁珠选择性的吸附DNA片段。经漂洗后，洗脱得到的DNA纯度良好，可用于测序、酶切、PCR、克隆等下游实验。

试剂盒组成：

组份	96次
Buffer MG	90ml
Buffer GW1	52ml
Buffer GW2	50ml
Buffer EB	30ml
Magbeads PN	2×1ml

自备仪器及试剂：
1、手动单管提取：恒温混匀仪；2/15ml磁力架；异丙醇、无水乙醇
2、手动96孔深孔板提取：恒温混匀仪；废液抽吸系统；手动连续分液器；电动连续分液器；手动连续分液器分液管(25ml)；96孔板磁力架；异丙醇；无水乙醇

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、电泳时使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果。
2、切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。
3、Magbeads严禁冰冻、离心。冰冻和离心可能会对Magbeads造成不可逆的损害。
4、Magbeads使用前需涡旋震荡20秒使其充分混匀。
5、如Buffer MG中出现沉淀，请在50℃水浴锅中重新溶解，摇匀后即可使用。
6、首次使用前应按试剂瓶标签在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇并做好标记。
7、实验过程中，磁珠在溶液中的充分混匀对于提取的得率与纯度都有很大的影响。实验过程中务必使磁珠与溶液充分混匀。不同厂家生产的恒温混匀仪震荡混匀效果有一定差异，实验过程中请注意观察磁珠状态。如出现磁珠贴壁等未充分混匀的现象，请用移液器吹吸混匀或调整震荡频率。

操作步骤：

一、手动单管操作：
1、在长波紫外灯照射下将目的条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量去除多余的琼脂糖凝胶)，称重后将其放入干净的1.5ml离心管中。
2、向离心管中加入3倍胶体积的Buffer MG(如果胶块重0.1 g，其体积为100μl)后，将其放入50℃的水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡5秒钟。
3、将离心管从水浴锅中取出，检测胶块是否完全融化以及溶液是否由黄色变成紫色(如胶块未完全溶解，将离心管放回水浴锅中继续孵育；如溶液颜色由黄色变成紫色，向离心管中加入10μl 3M的醋酸*溶液)。短暂离心后，将离心管室温放置5分钟。
4、向离心管中加入20μl充分混匀的Magbeads，涡旋震荡5秒钟后将其放入25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或连续颠倒混匀10分钟。
5、将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
6、将离心管从磁力架上取下，加入750μl Buffer GW1后涡旋点震1分钟或涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
7、将离心管从磁力架上取下，加入750 ul Buffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
8、重复步骤7。
9、保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5-10分钟，使乙醇挥发干净。
注意：如果离心管侧壁上有液珠，可向离心管中加入750μl无水乙醇。盖盖后颠倒离心管(保持离心管固定于磁力架上)，之后彻底弃去无水乙醇。
10、将离心管从磁力架上取下，加入30-100μl Buffer EB。涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于50℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于50℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟。
11、将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。

二、手动96孔板操作：
1、在长波紫外灯照射下将目的条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量去除多余的琼脂糖凝胶)，称重后将胶块放入2ml 96孔深孔板(简称“深孔板”)中并记录每孔中的样品名称。
2、向深孔板中加入3倍胶块体积的Buffer MG(如果胶块重0.1 g，其体积为100μl)，盖盖后将96孔板放入50℃的水浴锅中孵育10分钟，期间将深孔板放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2次，每次10秒钟。
3、将深孔板从水浴锅中取出放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟，用8通道移液器向深孔板中加入20μl充分混匀的Magbeads。之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟。
4、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
注意：用废液抽吸系统去除溶液时需将真空泵调节至较小的负压力值，使溶液以一个合适的速度被吸走,速度过快会造成磁珠的丢失。
5．用手动连续分液器或8通道移液器向深孔板中加入500μl Buffer GW1(加入前检查是否已加入无水乙醇)，之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀3分钟。
6、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
7、用手动连续分液器或8通道移液器向深孔板中加入500μl Buffer GW2(加入前检查是否已加入无水乙醇)，之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀3分钟。
8、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
9、重复步骤7-8。
10、用手动连续分液器或8通道移液器向96孔深孔板中加入500μl无水乙醇，之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀1分钟。
11、将板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
12、保持深孔板固定于96孔板磁力架上，将深孔板倒置于干净的吸水纸上放置2分钟。之后将深孔板从96孔板磁力架上取下放于100℃、1600 rpm的恒温混匀仪上静置5分钟。
13、用电动连续分液器或8通道移液器向深孔板加入50-100μl Buffer EB，之后将深孔板放于100℃(因该恒温混匀仪为悬空加热，洗脱液实际温度在50-60℃之间)、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀10分钟。
14、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟，用8通道移液器溶液转移至96孔PCR板中盖盖后-20℃保存备用。

储存条件：室温(15～30℃)


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ARB13071 小鼠肿瘤坏死因子β(TNF-β)酶标法分析 Mouse tumor necrosis factor β,tnf-β ELISA KIT
ARB13406 芜菁花叶病毒(TuMV)酶免分析 
PY02-303  5%乳糖发酵管培养基  250克  
动物组织总RNA提取试剂盒 
ARB14097 人白细胞介素17A(IL-17A)Elisa方法检测 Human interleukin 17a (IL-17a) ELISA KIT
96949-21-2 中性树胶
派洛宁Y TFA 92-32-0
糖原PAS染色液(细胞专用)   4×20ml|4×50ml
ARB12965 小鼠血管紧张素原(AGT)代做ELISA实验 Mouse angiotensinogen,agt ELISA KIT
ARB12934 小鼠过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(PPAR-γ)elisa检测操作说明书 Mouse peroxisome prolifeRator-activated receptor γ,ppar-γ ELISA KIT
BTN130596 荧光染色细胞凋亡检测试剂盒 Fluorescent Staining Apoptosis Detection Kit
DL-*甘*酸 (S)-2-Phenylglycine methyl ester hydrochloride 2835-06-5
三乙*(代"烯")四胺六乙酸 Rhodamine B 869-52-3
L-谷*酸溶液  0.2mol/L 100ml
ARB10222 人β细胞素(BTC)elisa检测 Human beta cellulin,btc ELISA KIT
F040304 山羊IgG抗原 Goat IgG
BL1166 动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒
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·IHC复染试剂(改良型苏木素)
编号：WE0322
英文名称：Improved-Hematoxylin
规格：10ml
  苏木精是一种碱性染料，它被氧化后生成氧化苏木精即苏木素后，可将细胞核和细胞内核糖体等嗜碱性结构染成蓝紫色，是常用的细胞核复染试剂。本产品是经改良的Mayer’s苏木素，不含酒精，可用于免疫组化DAB或AEC显色后的细胞核复染。其染色强度适中，一般不需要进行分化处理。复染后核着色鲜亮，背景清晰。

注意事项：
1、操作时应佩戴手套。
2、如核染色过深，可用1%盐*(代"酸")酒精分化适当液分化后，再用PBS或去离子水浸泡切 片3-5分钟，使胞核返蓝。
3、为得到ZJ实验结果，请根据实验具体需求，调整试剂用量。

操作步骤：
1、免疫组化常规操作完成后，DAB或AEC显色(HRP系统)。
2、显色强度合适时，用自来水冲洗终止显色。
3、甩去样品上的自来水，滴加适量改良型苏木素以覆盖整个组织，复染30秒至3分钟。
4、用自来水完全冲洗掉复染液，PBS或去离子水浸泡切片3-5分钟，使胞核返蓝。
5、脱水、透明、封片。

实验图例：

乳腺癌 CK19 胞浆阳性使用DAB显示试剂盒(WE0323)显色，改良型苏木素(WE0322)复染，结果图

储存条件：室温

·miRNA cDNADY链合成试剂盒
编号：WE0157
英文名称：miRNA cDNA Synthesis Kit
规格：25次
  本试剂盒采用在miRNA 3’末端加多聚A尾的方法来使miRNA具有Poly(A)尾，之后再使用Oligo(dT)-Universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应，ZZ合成miRNA对应的DY链cDNA。

  miRNA cDNADY链合成试剂盒包含miRNA 3’末端Poly(A)尾修饰过程及修饰后逆转录过程需要的全部试剂。该试剂盒具有非常高的Poly(A)修饰和逆转录效率，可以从1ng-2μg的total RNA中有效获得miRNA对应的cDNADY链。并且操作简便、快捷，可以用于从一个反应合成的cDNA中同时检测多种miRNA，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通量。

试剂盒组成：

组份	25次
Tris-Hcl，1 mM，PH 8.0	1ml
E.coli Poly(A)Polymerase，5U/μl	15μl
10×Poly(A)Polymerase Buffer	80μl
ATP，10 mM	15μl
RT Primer，25μM	90μl
5×UltraRT Buffer	120μl
UltraPure dNTP Mix，10 mM each	30μl
UltraRT	15μl
RNase-Free Water	1ml

备注：本试剂盒须与miRNA荧光定量检测试剂盒(WE0158)配套使用。

自备实验材料：1ng-2μg的总 RNA，或0.1ng-1μg的小分子RNA。

注意事项：
预防RNase污染，应注意以下几方面：
1、使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2、玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
3、配制溶液应使用无RNase的水。
4、操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

使用方法：

A．miRNA加Poly(A)尾的过程：
1、首先根据所用RNA的量，按如下公式，用1 mM Tris(PH8.0)来稀释10 mM ATP：
ATP稀释系数=5000/__ng的总RNA
例：如果总RNA的起始用量为100ng，那么ATP稀释系数=5000/100=50。即将ATP稀释50倍(1μl的10 mM ATP加49μl的1 mM Tris，PH8.0)。
2、向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入以下试剂至总体积25μl。
 

试剂	25μl反应体系	终浓度
total RNA	Xμl	可达2μg
10×Poly(A)Polymerase Buffer	2.5μl	1×
第“1”步中稀释好的ATP	1μl	—
E.coli Poly(A)Polymerase, 5U/μl	0.5μl	2.5 U
RNase-Free Water	up to 25μl	—

注意：反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。

此过程也可以直接使用小分子RNA(建议加入量为2-5μl。请根据目的miRNA的丰度来确定加入量)。

3、轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。37℃，孵育15分钟。此过程结束后，立刻进行DY链cDNA的合成，或于-20℃暂存。如需长期保存，建议存放于-80℃。

B．修饰后的miRNA cDNADY链合成的过程：
1、向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入下表中试剂，至终体积20μl：
 

试剂	20μl反应体系
上述Poly(A)反应液	4μl
UltraPure dNTP Mix，10 mM each	1μl
RT Primer，25 μ M	3μl
5×UltraRT Buffer	4μl
UltraRT	0.5μl
RNase-Free Water	7.5μl

2、轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。42℃，孵育50分钟。
3、85℃，孵育5分钟，终止反应。合成的cDNA反应液可以直接进行荧光定量检测实验，也可以于-20℃保存备用。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

北京百莱博科技有限公司是克隆与表达产品的专业生产供应销*(代"售")商，恭候您的咨询选购TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)促销。