TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)现货供应

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、YL及其他非科研用途。

北京百奥莱博专业生产销*(代"售")TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)现货供应，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)现货供应
产地：国产|进口
规格：20次
英文名：pUC-T Simple TA Cloning Kit
编号：WE0247
品Pai：百奥莱博
  pUC-T Simple载体是一种GX克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在EcoR V酶切位点处切开，在两侧的3＇端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3＇端添加一个A，可以与pUC-T 3＇端的T互补连接，同时它消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时，酶切反应将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。
  试剂盒中配备GX率的T4 DNA Ligase和为快速GXDNA连接优化的2×Quick Ligation Reaction Buffer。连接效率相当于用T4 DNA Ligase 进行常规连接1小时。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物对PCR产物进行测序。

试剂盒组成：

 

组份	20次
pUC-T Simple(50 n g/μl)	20μl
Control Insert(50ng/μl)	10μl
Quick T4 DNA Ligase	20μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	120μl

注意事项：

1、Insert DNA 要求
1)连接使用的PCR片段3’末端应带有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的Pfu扩增的PCR产物是平滑末端，可使用加A试剂盒加上A尾后，再进行T载体克隆。
2)PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆，以免PCR产物中的非特异片段或残存引物等杂质影响。推荐使用WE0168快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

2、连接反应要求
1)本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点，增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应1小时后，转化效率会明显降低；如25℃快速连接反应过夜，则转化效率会下降到75%。
2)2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混匀，建议初次使用分装成小管冻存，避免其反复冻融影响DNA连接效率。
3)由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用之前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深，以免粘在枪头上造成损失。
4)如快速连接产物用于电转，因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率，建议使用离心柱将连接产物进行DNA纯化(如WE0170快速DNA产物纯化试剂盒)后再进行电转。

3、感受态细胞要求
建议使用GX的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型(F´编码的【lacZ ΔM15】)产生ω片段，才能与载体DNA产生的LacZ α 多肽结合，表现出β-半乳糖苷酶活性(α互补)。pUC-T Simple载体以pUC18载体为基础构建而成，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用。推荐使用本公司WE0251 TOP10感受态细胞、WE0252 DH5α感受态细胞。

4、阳性克隆筛选
阳性DNA片段成功插入至pUC-T Simple Vector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。

5、阳性对照
为了确认实验操作的正确性，以及实验试剂的有效性，我们建议使用本试剂盒中配备的Control Insert(750 bp)进行阳性对照实验。

使用方法：

1、按以下体系配制反应液：

成分	反应体系	对照体系
pUC-T Simple(50ng/μl)	1μl	1μl
DNA 插入片段 *	0.1 -0.3 pmol	--
Control Insert DNA	--	1μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	5μl	5μl
Quick T4 DNA Ligase	1μl	1μl
RNase-Free Water	补足至10μl	补足至10μl

Insert DNA的使用量：在进行克隆时，Vector DNA和 Insert DNA的摩尔比一般为：1:2-1:10，可根据实验情况选择适当的Vector DNA和 Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA的使用量=nmol数×660×Insert DNA bp数。本载体1μl(50ng)的摩尔数约为0.03 pmol。

2、轻轻混合，短暂离心。25℃反应5分钟。
注意：反应时间不要超过15分钟，否则会降低连接效率。
3、反应结束后，将DNA连接产物存放于0-4℃，而后进行转化实验；也可将DNA连接产物置于-20℃保存。
注意：勿进行加热失活反应。
4、将连接产物加入50μl感受态细胞中(将感受态细胞置于冰上融化)，冰浴30分钟。
注意：用化学法转化时，连接产物的加入量不要超过感受态细胞体积的10%。
5、42℃热击45秒钟，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
6、加入450μl无菌SOC或LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟，使菌体复苏。
7、根据实验要求，取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16小时。
8、计算白、蓝色菌落，挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。




储存条件：-20℃。

关于TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)现货供应的更详细说明，请致电我公司咨询，我们将以最饱满的热情为您提供解答，此外，我公司专业供应下列产品：

·磁珠法口腔拭子DNA提取试剂盒
编号：WE0209
英文名称：Magbead Swab DNA Extraction Kit
规格：96次
  本试剂盒提供了一种简单、快速、GX的口腔拭子DNA提取方法，适用于从干燥保存或在保护液中保存的口腔拭子中提取基因组DNA。在高盐存在时，DNA结合于硅基包被的Magbeads表面。漂洗后，高纯度的DNA被洗脱于Buffer EB或去离子水中。纯化得到的DNA纯度好(A260/280的比值在1.7-1.9之间)，完整度高(>15 kb)，可用于二代测序、定量PCR、芯片检测等下游实验。

试剂盒组成：

组份	96次
Buffer WL	36ml
Buffer ML	36ml
Buffer GW1(浓缩液)	80ml
Buffer GW2(浓缩液)	50ml
Buffer EB	30ml
蛋白酶K	2×25mg
蛋白酶K 储存液	2×1.25ml
Magbeads PN	1ml

自备仪器及试剂：

1、手动单管操提取：
1)恒温混匀仪
2)2/15ml磁力架
3)异丙醇、无水乙醇

2、手动96孔深孔板提取：
1)恒温混匀仪
2)废液抽吸系统
3)手动连续分液器
4)电动连续分液器
5)手动连续分液器分液管
6)96孔深孔板磁力架
7)异丙醇、无水乙醇

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、向蛋白酶K 中加入指定用量(1.25ml/25mg)的蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配置好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2、Magbeads严禁冰冻、离心。冰冻和离心可能会对Magbeads造成不可逆的损害。
3、Magbeads使用前需涡旋震荡20秒使其充分混匀。
4、首次使用前应按试剂瓶标签在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇并做好标记。
5、实验过程中，磁珠在溶液中的充分混匀对于提取的得率与纯度都有很大的影响。实验过程中务必使磁珠与溶液充分混匀。不同厂家生产的恒温混匀仪震荡混匀效果有一定差异，实验过程中请注意观察磁珠状态。如出现磁珠贴壁等未充分混匀的现象，请用移液器吹吸混匀或调整震荡频率

操作步骤：

I、手动单管操作：

方案一(用于从干燥保存的口腔拭子中提取基因组DNA)：
1、将口腔拭子的棉签用剪刀从杆上剪下，置于2.0ml的离心管中。
2、向离心管中加入20μl 蛋白酶K 和300μl Buffer WL，之后将离心管放于56℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡裂解30分钟。
注意：如无恒温混匀仪，将离心管我选振荡10秒后放于56℃水浴锅中孵育30分钟，期间每隔5分钟涡旋振荡10秒钟。
3、将离心管从恒温混合仪上取下，短暂离心后加入300μl Buffer ML。之后将离心管放于56℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡裂解10分钟。
注意：如无恒温混匀仪，将离心管我选振荡10秒后放于56℃水浴锅中孵育30分钟，期间每隔5分钟涡旋振荡10秒钟。
4、将步骤3中的离心管短暂离心后室温放置5分钟，之后将裂解产物转移至1.5ml的离心管中。向离心管中加入200μl异丙醇和10μl充分混匀的Magbeads，涡旋震荡5秒钟后将离心管放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将离心管连续颠倒混匀10分钟。
5、将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
6、将离心管从磁力架上取下，加入750μl Buffer GW1(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
7、重复步骤6。
8、将离心管从磁力架上取下，加入750μl Buffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
9、重复步骤8。
10、保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5-10分钟，使乙醇挥发干净。
注意：如果离心管侧壁上有液珠，可向离心管中加入750μl无水乙醇，盖盖后颠倒离心管(保持离心管固定于磁力架上)，之后彻底弃去无水乙醇。
11、将离心管从磁力架上取下，加入30-100μl Buffer EB。涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟。
12、将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。

方案二(用于从在保护液中保存的口腔拭子中提取基因组DNA)：
1、将口腔拭子的棉签从杆上剪下，置于2.0ml的离心管中。
2、向离心管中加入20μl 蛋白酶K 、300μl保存该拭子的保护液和200μl Buffer ML，之后将离心管放于56℃、1600 rpm的恒温混合仪上震荡裂解30分钟。
注意：如无恒温混匀仪，将离心管我选振荡10秒后放于56℃水浴锅中孵育30分钟，期间每隔5分钟涡旋振荡10秒钟。
3、将离心管从从恒温混合仪上取下，室温放置5分钟。短暂离心后，将裂解产物转移至1.5ml的离心管中。
4、向离心管中加入300μl异丙醇和10μl充分混匀的Magbeads，涡旋震荡5秒钟后将离心管放于25℃、1600 rpm的恒温混合仪上震荡混匀5分钟或将离心管连续颠倒混匀10分钟。
5、将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后充分弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
6、将离心管从磁力架上取下，加入750μl Buffer GW1(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
7、重复步骤6。
8、将离心管从磁力架上取下，加入750μl Buffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
9、重复步骤8。
10、保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5-10分钟，使乙醇挥发干净。
注意：如果离心管侧壁上有液珠，可向离心管中加入750μl无水乙醇，盖盖后颠倒离心管(保持离心管固定于磁力架上)，之后彻底弃去无水乙醇。
11、将离心管从磁力架上取下，加入30-100μl Buffer EB。涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟。
12、将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。

II、手动96孔板操作：

方案三(用于在96孔深孔板中从干燥保存的口腔拭子中提取基因组DNA)：
1、将口腔拭子棉签剪下放入96孔深孔板(简称“深孔板”)中并记录每个孔中样品名称。
2、向加入口腔拭子的深孔板中用电动连续分液器或8通道移液器加入20μl 蛋白酶K 和 300μl Buffer WL，之后将深孔板放于100℃(该恒温混匀仪为悬空加热，裂解液实际温度在50-60℃之间)、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡孵育30分钟。
3、将深孔板从恒温混匀仪上取下，加入300μl Buffer ML。之后，将深孔板放于100℃(该恒温混匀仪为悬空加热，裂解液实际温度在50-60℃之间)、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡孵育10分钟。
4、将深孔板从恒温混合仪上取下，把裂解产物按照顺序转移至新的深孔板中。
5、向新的深孔板中加入210μl充分混匀的异丙醇(200μl)与Magbeads(10μl)混合物。之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混合仪上震荡混匀5分钟。
6、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
注意：用废液抽吸系统去除溶液时，需将真空泵调节至较小的负压值，使溶液以一个合适的速度被吸走，速度过快容易造成磁珠的流失。
7、用手动连续分液器向深孔板中加入500μl Buffer GW1(加入前检查是否已加入无水乙醇)，之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟。
8、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
9、重复步骤7-8。
10、用手动连续分液器向深孔板中加入500μl Buffer GW2(加入前检查是否已加入无水乙醇)，之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀3分钟。
11、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
12、重复步骤10-11。
13、用手动连续分液器向96孔深孔板中加入500μl无水乙醇，之后将深孔板固定于25℃、 1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀1分钟。
14、将板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
15、保持深孔板固定于96孔板磁力架上，将深孔板倒置于干净的吸水纸上放置2分钟。之后将深孔板从96孔板磁力架上取下放于100℃、1600 rpm的恒温混匀仪上静置5分钟。
16、用电动连续分液器或8通道移液器向深孔板加入50-100μl Buffer EB，之后将深孔板放于100℃(因该恒温混匀仪为悬空加热，洗脱液实际温度在50-60℃之间)、 1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀10分钟。
17、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟，用8通道移液器溶液转移至96孔PCR板中盖盖后-20℃保存备用。

方案四(用于在96孔深孔板中从在保护液中保存的口腔拭子中提取基因组DNA)
1、将口腔拭子棉签剪下放入96孔深孔板(简称“深孔板”)中并记录每个孔中样品名称。
2、向加入口腔拭子的深孔板中用电动连续分液器或8通道移液器加入20μl 蛋白酶K 、300μl保护该拭子的保护液和200μl Buffer ML，之后将深孔板放于100℃(该恒温混匀仪为悬空加热，裂解液实际温度在50-60℃之间)、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡孵育30分钟
3、将深孔板从恒温混匀仪上取下，把裂解产物按照顺序转移至新的深孔板中。
4、向新的深孔板中加入310μl充分混匀的异丙醇(300μl)与Magbeads(10μl)混合物。之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混合仪上震荡混匀5分钟。
5、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
注意：用废液抽吸系统去除溶液时，需将真空泵调节至较小的负压值，使溶液以一个合适的速度被吸走，速度过快容易造成磁珠的流失。
6、用手动连续分液器向深孔板中加入500μl Buffer GW1(加入前检查是否已加入无水乙醇)，之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟。
7、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
8、重复步骤6-7。
9、用手动连续分液器向深孔板中加入500μl Buffer GW2(加入前检查是否已加入无水乙醇)，之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀3分钟。
10、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
12、用手动连续分液器向96孔深孔板中加入500μl无水乙醇，之后将深孔板固定于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀1分钟。
13、将板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟。用废液抽吸系统或8通道移液器弃去溶液，期间避免枪头接触磁珠。
14、保持深孔板固定于96孔板磁力架上，将深孔板倒置于干净的吸水纸上放置2分钟。之后将深孔板从96孔板磁力架上取下放于100℃、1600 rpm的恒温混匀仪上静置5分钟。
15、用电动连续分液器或8通道移液器向深孔板加入50-100μl Buffer EB，之后将深孔板放于100℃(因该恒温混匀仪为悬空加热，洗脱液实际温度在50-60℃之间)、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀10分钟。
16、将深孔板从恒温混匀仪上取下后放于96孔板磁力架上静置2分钟，用8通道移液器溶液转移至96孔PCR板中盖盖后-20℃保存备用。

储存条件：室温(15～30℃)


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