小鼠快速基因型鉴定试剂盒

小鼠快速基因型鉴定试剂盒
 
本试剂盒专为小鼠快速基因型鉴定（Genotyping）而研制。试剂盒中包含的GX组织消化液（Protease S）能够迅速从小鼠尾巴、耳朵或脚趾等组织中释放足量的基因组DNA，并且无需对其进行抽提与纯化，可直接将消化产物作为模板加入2 x PCR Master Mix中进行PCR扩增，PCR扩增产物（含有染料）可直接点样进行电泳观察。实验操作简便而省时。
 
应用范围
 
小鼠基因型鉴定（尾巴、耳朵或脚趾）
小鼠基因组DNA扩增、测序
 

	(100 rxns)	(200 rxns)	(500 rxns)
Buffer A (mL)	10	20	50
Buffer B (ul)	30	60	150
2 xPCR master Mix (mL)	1	2	5

 
储存条件
 
Buffer A 4℃保存，其余组分-20℃保存。保质期一年。
 
操作步骤
1. 组织消化
1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：
      （单样本）

	（单样本）
Buffer A	100 μL
Buffer B	0.3 μL

 
1.2 小鼠组织完全浸没于消化液中
56℃，15-30分钟；
95℃， 5分钟
,
2. PCR扩增
2.1. PCR反应体系：
反应体系的配制于低温环境下（如冰浴）完成，以保证PCR扩增效率和扩增特异性。

PCR 反应组分	20 μL 反应体系 (μL)	50 μL 反应体系 (μL)
ddH2O	7	18
正向引物 (10 μM)	0.5	1
反向引物 (10 μM)	0.5	1
模板（消化产物）	2	5
2 x PCR master Mix	10	25

 
2.2. PCR反应条件：

温度 (℃)	时间	循环数
94	5 min	1
94	20 sec	30-40
50-65	30 sec
72	X min (2kb/min)
72	5 min	1
12	--	1

PCR产物的3’端带有碱基A，可直接克隆至T载体，用于DNA测序。
 
3. 琼脂糖凝胶电泳
试剂2 x PCR Master Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。常见问题与对策

常见问题	可能原因	对策
样本组与阳性对照组均无扩增条带	PCR反应条件设置不当	优化PCR反应条件
	PCR引物质量问题	重新设计PCR引物
样本组无扩增条带而阳性对照组正常	不当储存或长期储存引起试剂活性丧失	使用新鲜的试剂
	组织消化不够充分	延长56℃消化时间至1-3小时
	蛋白酶未被完全灭活	消化产物在95-100℃孵育5 min
存在非特异性扩增条带	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度
	PCR引物错配	重新设计PCR引物
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应

 
效果示意图