一站式慢病毒稳转细胞株筛选构建

1.     目的基因合成和表达载体构建

1） 目的基因合成

2） 选择合适的表达载体，目的基因合成后直接连接构建

3） 测序验证

2.     表达质粒载体

1） 质粒转化细菌扩增

2） 质粒抽提纯化

3） 酶切电泳以及测序再验证

3.     慢病毒包装

1） 试剂：表达载体、慢病毒载体系统、293T细胞和转染试剂

2） 共孵育及收集含病毒上清液

3） 病毒纯化和浓缩

4） 病毒保存（-80℃）

4.     慢病毒感染目的细胞预实验

1） 优化条件：细胞种板密度、病毒最适MOI、是否需要polybrene辅助感染试剂等

2） 荧光观察或者FACS检测感染效率

5.     药物筛选浓度优化

1） 药物浓度梯度

2） 处理48小时后细胞全部死亡的ZD药物浓度为后续实验拟用浓度

6.     正式实验

1） 慢病毒感染

2） 荧光观察

3） 药物筛选多克隆细胞稳转株（或者FACS分选表达GFP的细胞）

4） 有限稀释单克隆细胞株筛选及扩大培养

7.     鉴定

1） 荧光拍照

2） 目的基因qPCR检测

3） Flag或目的基因表达蛋白的Western blot检测

 

1.     选择至少3个不同的靶点，设计shRNAs

2.     合成对应的序列并构建表达载体

3.     后续慢病毒感染细胞及筛选，步骤基本与LentiOE-Stable相同

4.     注意事项

1） 单克隆分析前需要筛选出干扰效率ZG的siRNA。经抗药基因初步筛选后，提取RNA以qPCR检测目的基因干扰效率。

2） 筛选出的siRNA再进行单克隆分析，以qPCR检测筛选出干扰率ZG的稳转株，再以WB鉴定选出敲减效果的稳转株。

3） 需关注细胞存活率和生长状态。某些基因敲减会造成生长缓慢或者致死表型，因此药物筛选会有影响，需要将细胞以低密度种板进行单克隆筛选，或者可选择FACS分选表达GFP的细胞再分析。也可选择可诱导型RNAi表达载体。
 

1.     选择至少3个不同的靶点

2.     Cas9载体构建

3.     慢病毒感染及筛选同前

说明：本项实验ZD在于前期序列设计及载体构建。